Préparation d’échantillons histologiques pour la microscopie optique

General Laboratory Techniques

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Summary

L’histologie est l’étude des cellules et des tissus, ce qui est typiquement assisté par l’utilisation d’un microscope optique. La préparation d’échantillons histologiques peut varier grandement sur base des propriétés intrinsèques des échantillons comme la taille et la dureté ainsi que la procédure espérée en aval qui inclut des techniques de coloration planifiées ou d’autres utilisations en aval.

Comme décrit dans cette vidéo, la préparation de l’échantillon commence typiquement avec une procédure de fixation pour empêcher la dégradation de l’échantillon par les enzymes naturellement relâchés par les cellules à leur mort. Une fois fixés, les échantillons sont placés dans un milieu d’implantation qui est capable de soutenir suffisamment l’échantillon. Le plus souvent c’est une cire de paraffine, mais d’autres matériaux comme un milieu gelé à base de glycérine ou un milieu à base de gélose sont aussi utilisés pour entourer l’échantillon pendant la découpe. L’amincissement (coupe) prend alors place dans un microtome ou une autre machine de coupe qui permet à l’utilisateur de raser l’échantillon en fines tranches d’épaisseur allant de quelques microns à quelques millimètres. Une fois coupées, les tranches sont montées sur une lame de verre et colorées pour mettre en évidence les caractéristiques de l’échantillon avant d’être visualisées par un microscope.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Les techniques générales de laboratoire. Préparation d’échantillons histologiques pour la microscopie optique. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

L’histologie est un terme qui fait référence à l’étude de l’anatomie microscopique des tissus et des cellules. Une bonne préparation d’échantillon histologique pour la microscopie optique, est essentielle pour l’obtention de résultats de haute qualité, à partir d’échantillons de tissus.

Il y a 3 étapes principales communes à la majorité des procédures histologiques. Tout d’abord, l’échantillon est fixé, en vue de préserver le tissu et de ralentir sa dégradation. Ensuite, l’échantillon est immergé dans une substance, ou milieu d’implantation, aux propriétés mécaniques similaires. Une fois implanté, l’échantillon est sectionné en fines tranches, en utilisant un outil de coupe précis appelé microtome. Cette vidéo décrit ces étapes générales et quelques uns des concepts qui y sont relatifs.

La fixation de tissus est une étape critique, qui préserve les composants des cellules et tissus, et maintient leur structure naturelle. A la suite de la mort des cellules, des enzymes naturels sont relâchés par les organites, et ces enzymes commencent à dégrader les protéines intracellulaires et extracellulaires qui maintiennent l’intégrité de la structure de la cellule et des tissus environnant. La fixation empêche une telle dégradation en inhibant directement l’habilité de ces enzymes à digérer les protéines, et en rendant les sites de clivage des enzymes non-reconnaissables.

Les deux mécanismes principaux de fixation sont la réticulation et la coagulation. La réticulation implique la formation de liaisons covalentes, à la fois à l’intérieur de protéines et entre elles, ce qui provoque le durcissement des tissus et donc leur résistance à la dégradation. La coagulation est provoquée par la déshydratation des protéines à travers l’utilisation d’un solvant organique comme l’alcool, pour déformer les protéines 3D ou à structure tertiaire, de manière à ce que les régions hydrophobiques, ou effrayées par l’eau, se déplacent vers la surface. La fixation par coagulation peut aider le milieu d’implantation, comme la cire de paraffine, à pénétrer dans les tissus.

L’un des fixateurs le plus couramment utilisés est le Formol : du formaldéhyde dissout dans de l’eau. Lors de la fixation, le formaldéhyde s’attache aux amines primaires, tels que ceux trouvés sur les chaines de côté des acides aminés lysine et glutamine, pour former une réticulation stable appelée pont de méthylène. Ce procédé est intrinsèquement lent et peut prendre jusqu’à 1 ou 2 jours.

Avant la fixation, quelques considérations sont à prendre en compte. Tout d’abord, considérez la diffusivité de l’échantillon. Les fixateurs vont diffuser sur une certaine distance à travers les tissus, à une vitesse relative au coefficient de diffusion du fixateur multiplié par la racine carrée du temps. Un fixateur qui met 1 heure pour pénétrer de 1 mm dans l’échantillon, prendra 25 heures pour pénétrer 5 mm. Une fois que le formol a atteint le centre du tissu, la réaction de réticulation doit encore avoir lieu. Ainsi, la taille de l’échantillon devrait être limitée à 4 mm d’épaisseur pour une fixation minutieuse dans un temps raisonnable.

Deuxièmement, considérez le volume et le pH du fixateur. Le ratio du volume du fixateur sur le volume de l’échantillon devrait être au moins de 40:1, de manière à ce que le réactif ne soit pas facilement réduit au cours du temps. Alors que certains fixateurs sont conçus pour travailler à un pH acide, le formol travaille mieux lorsqu’il est tamponné avec du phosphate pour maintenir un pH neutre, de manière à ce qu’un excès d’acide ne soit pas produit, ce qui provoquerait des artefacts dans le tissu.

L’étape suivante dans la préparation histologique est l’implantation, qui implique de placer les prélèvements dans un milieu qui a une rigidité mécanique similaire à celle du prélèvement. Le choix du milieu d’implantation adéquat est critique, car s’il est trop raide ou trop frêle, des défauts pourraient apparaitre lors de l’amincissement. La cire de paraffine est de loin le milieu le plus courant utilisé pour l’implantation.

Avant l’implantation dans la paraffine, les échantillons doivent être déshydratés en remplaçant l’eau dans le tissu, d’abord avec de l’éthanol suivi par du xylène, et finalement de la cire de paraffine chaude. Une fois que la cire a infiltré l’échantillon, il faut le positionner précautionneusement et l’entourer avec plus de cire en utilisant un moule pour former un bloc. Ensuite, les échantillons sont attachés à une cassette de tissu pour la coupe.

L’amincissement est le procédé de découpage du bloc d’implantation en fines tranches d’échantillon. Les sections sont généralement de l’ordre de 4 à 10 μm d’épaisseur pour une utilisation en microscopie optique.

Pour couper des sections, une lame en métal, en verre ou en diamant est d’abord sécurisée sur un microtome. L’échantillon est alors placé dans un porte-échantillon. Ensuite, l’échantillon est placé contre la surface de découpe et passé de haut en bas sur la lame pour créer une tranche d’épaisseur désirée. Les échantillons créeront de fins rubans qui peuvent être placés sur des lames de verre.

Pour des échantillons implantés dans de la paraffine, les tranches sont d’abord placées dans un bain d’eau chaude et sont ensuite retirées de l’eau sur une lame et mises à sécher.

Le tissu biologique a un contraste intrinsèque très faible, donc après l’histologie, les tranches sont généralement teintées avec des colorants ou des anticorps qui mettent en évidence la morphologie cellulaire ou les protéines spécifiques. Le colorant le plus couramment utilisé est l’hématoxyline et l’éosine, ou H&E. Du fait qu’il soit si courant, beaucoup de machines automatisées ont été construites pour colorer de nombreuses sections de manière similaire. L’hématoxyline colore le noyau des cellules en bleu, et l’éosine colore le cytoplasme en rose, révélant la morphologie cellulaire des tissus.

Un inconvénient à la fixation est que la réticulation de protéines peut la rendre plus difficile, en empêchant les anticorps étiqueteurs de trouver leurs sites de liaison. Plutôt que d’utiliser la fixation pour préserver les échantillons, la congélation rapide de tissu peut être utilisée, qui sera suivie par une technique de coupe appelée cryo-coupe.

Les échantillons de tissu sont implantés et orientés dans un milieu spécial de congélation appelé OCT, pour milieu à « optimal cutting temperature » et ensuite rapidement gelés. Comme d’autre milieu d’implantation, la rigidité de l’OCT correspond à celle de l’échantillon.

Un cryo-microtome est utilisé pour couper les sections gelées, et cet instrument maintient une température interne de -20°C pour garder la lame de coupe et les échantillons froids. En opposition aux sections d’implantations par paraffine, les sections gelées peuvent être directement poussées sur une lame de verre chargée positivement immédiatement après la coupe.

Un autre moyen d’éviter la fixation est l’implantation sur gélose, dans laquelle les échantillons sont couverts avec de la gélose liquide fraichement préparée. Une fois que la gélose est refroidie, et que le tissu est enfermé, la gélose en excès peut être taillée.

Un vibratome, une autre alternative au microtome, a une lame qui vibre et se déplace à travers l’échantillon implanté dans la gélose. Les vibratomes sont utilisés pour créer de fines sections de l’ordre de 50 à 1000 μm d’échantillons implantés dans la gélose.

Les échantillons sont typiquement retirés de la gélose avant la coloration, et alors placés sur une lame, entourés par une substance comme de la graisse à vide qui empêche la lamelle d’écraser l’échantillon. Un microscope confocal est ideal pour bien voir ces échantillons, en vue d’obtenir des images de haute résolution de chaque fine section.

Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la préparation d’échantillons histologiques pour la microscopie optique. Vous devriez maintenant comprendre les étapes impliquées dans la préparation d’échantillon pour vous amener d’un morceau de tissu à une tranche stable. Comme toujours, merci de nous avoir regardé !

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