细菌转化:电穿孔法

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

"转化”这一术语是指细胞摄入外源DNA。自然界中,某些类型的细菌可以发生转化。而在分子生物学中,可通过在细菌细胞壁上穿孔来人工诱导转化。能够从环境中接受DNA的细菌细胞被称为感受态细胞。可在实验室制备电穿孔感受态细胞,并通过施加电场在细胞壁上形成小孔让DNA穿过来转化这些细胞。

本短片讲解了用于电穿孔转化的设备,如电转化仪和电击杯。视频也演示了如何制备电穿孔感受态细胞和用电穿孔转化目的细胞的逐步步骤。也提到了通过观察时间常量来估计转化实验是否成功和电穿孔时去除掉溶液中的盐离子的重要性。

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JoVE Science Education Database. 细胞分子生物学中的基本方法. 细菌转化:电穿孔法. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

细菌转化是一种自然存在的过程,细菌摄入外源DNA, 然后扩增或克隆该DNA。在实验室里,该过程可人工诱导完成,使用高电压的电场在细菌膜上形成小孔,质粒DNA将由此穿过。该方法就是电穿孔法,接下来的视频将讲解它的原理,逐步操作和应用。

在讲细菌的电穿孔之前,很重要的一点是要了解该方法中用到的DNA类型-质粒。质粒是独立于染色体外,小的环状DNA,它作为载体用于携带您的特定DNA序列。

无论该序列是水母的荧光蛋白基因还是植物的一个酶基因,都可通过质粒上的一个被称为多克隆位点的区域插入到质粒。该区域包含可被限制性内切酶或称限制性酶切开的特定序列。可用同样的限制性酶来切开您的目的序列,这样它的末端就会与新切开的质粒末端互补。

质粒还包含一个复制原点,简称ORI,它是质粒开始复制的位置。转化实验中,抗生素抗性基因尤为重要。如它的名字所指,该基因使得细菌合成可中和抗生素的酶,从而使细菌可在含抗生素的培养液中存活。

电穿孔法要用到一种称为电转化仪的特殊设备。通常将细胞放在电击杯中,电击杯的两边有电极,这样插入到仪器中后会与之有电流通路。

将细菌细胞与DNA混合后上样到电击杯中,并在几微秒时间内施加1000伏到10000伏的电场。这样会在膜两边造成0.5到1伏的电压,据信这会使得细胞膜的磷脂双层重新排列,从而形成小孔。处于这个状态时,质粒DNA就能穿过膜。电脉冲停止后,膜将自身得到恢复。

细菌摄入质粒后,就可在含抗生素的琼脂糖培养板上生长。

现在我们已经了解了质粒和电穿孔转化机理。让我们来看看这个过程是如何操作的。

能够摄入DNA的细胞被称之为感受态细胞。分子生物学研究中用于转化最普遍的感受态细菌类型是大肠杆菌,它们是生活在人体大肠的原核细菌。为电穿孔转化而制备的大肠杆菌叫做电穿孔感受态细胞。

操作细菌时要时刻保证工作台尽可能的干净。

操作细菌还需要用到无菌技术。通常这要使用到本生喷灯来给器具灭菌,并用来形成一个空气对流 -- 让空气中的污染物远离工作台。

电穿孔开始前,要将培养液预热到室温,把含抗生素的琼脂糖平板放置到37度,在冰上冷却电击杯。

接下来,在冰上化冻清洗过的电转化感受态细胞。

向细胞中加入1-5微升1ng/μl冷却的不含盐离子的质粒溶液,轻轻混匀,再将混合物加入到冷却的电击杯中。要保证没有任何气泡产生。

针对您用的细胞类型在电转化仪上设定正确的电压和电场强度。这里您看到这个电转化仪被设置到了1700伏,产生的电场为17kV/cm。

将电击杯的表面擦干然后放到电转化仪中。用脉冲电击细胞直到您听到一声嘀声。

电击脉冲失败会导致电流泄漏,这时会有可见的火花并听到爆破声。这种泄漏,被称为电弧,是由于感受态细胞或DNA中含有过多盐分造成的。

转化是否成功可以通过观察时间参数来预测,它是在施加脉冲后电压消失用到的时间。如果有盐分存在,电穿孔溶液有强导电性,电压就会消失很快,造成泄漏,从而杀死很多细胞。对细菌而言,较好的时间常量为5-10毫秒。

电击后要立刻取出电击杯,直接向细胞中加入1毫升培养液。含细胞的培养液再被转移到管中并在37度震荡培养1小时,使细胞得到恢复。

然后,使用无菌操作技术将20-200微升细胞加到含抗生素的琼脂板上。将平板倒置让琼脂在顶部,这样凝集的水将不会滴到细胞上,37度培养过夜。

被质粒转化过的细菌将会形成菌落。计数菌落数目来计算转化效率,它是成功转化菌落的数目除以总DNA的量得到的数值。

为细菌提供营养的琼脂板和培养液,都需要预先制备并高压灭菌。使用前让液体培养基冷却到室温,让琼脂温度冷却到50-55度,在这个温度下加入抗生素,然后倾倒制板。

由于用于转化的细菌被保存在冻箱中,它们需要先在冰上化冻,在不含抗生素的琼脂板上铺板,然后37度过夜培养。

用无菌技术从琼脂板上挑取一个细菌菌落,接种到可多达500毫升的培养液中,37度摇床培养过夜。

细菌生长过程中,可以准备约1升的去离子水,并制备10%体积比的甘油与水的溶液。高压灭菌溶液后让它们在4度冷却。

用吸光度测定来判断细菌是否到达了生长的对数中期,这是它们容易摄入DNA的阶段。一旦细胞到达了这个阶段,将它们放置到冰上,并且接下来的整个过程中都要一直将它们保存在冰上。

然后将细胞分装到两个管子中,4度离心,弃掉上清,再重悬到冷却的100毫升无菌水中进行洗涤。重复此步骤至少一次。这一步的目的是去除盐离子,它将对电穿孔有很大的影响。

再用50毫升10%甘油水溶液洗涤细菌两次,并最后用此溶液重悬细菌。

加50微升细胞到多个微量离心管中。这些细胞已经可以用于电穿孔转化了,它们应保存在4度。或者它们也可以被速冻起来然后保存在-80度。

正如您即将看到的,电穿孔转化有很多的应用。

电穿孔转化的一个替代方法是热激法转化,它需要用到氯化钙和热激来处理细菌,从而将DNA导入细胞内。

通常,热激法要比电穿孔法更温和并且不需要低盐浓度。连接反应,就是将您的目的基因插入到质粒后形成的产物,可以被直接用来做热激转化。热激法比电穿孔法便宜,无需使用昂贵的设备或电击杯。但另一方面,热激法的转化效率要比电穿孔法低,并且耗时长。而且它仅局限于细菌,酵母和植物原生质体,而电穿孔法还可用于哺乳动物细胞。

这里您看到的是将小鼠的胚胎成纤维细胞放置在电击杯中。当电穿孔完成后,转化效率可通过观察细胞合成一种质粒编码的绿色荧光蛋白的表达程度来判断。转染这个术语是指对哺乳动物细胞的转化,它通常要比细菌细胞所需的电场强度低,并有更高的时间常数。

电穿孔还可用于整个动物,如您在这里看到的发育中的鸡胚胎。将质粒DNA注射到鸡的脑部,然后使用一个电穿孔探头在脑组织中施加电场。1到2天后,神经元将合成的质粒编码的绿色和红色荧光蛋白,科研人员可观察发育中鸡的脑组织的结构变化。

您刚观看的是JoVE关于电穿孔法转化细菌的介绍。本短片介绍了质粒这个最为常用的转化DNA类型,讨论了电穿孔的生物物理机理,演示了一个常用的操作电穿孔转化的过程,并描述了如何在哺乳生物中应用电穿孔转化。感谢您的观看。

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