酿酒酵母的培养和保存

Biology I

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Summary

在酿 酒酵母中进行的研究极大加深了我们对一些重要细胞进程,如细胞周期调控,衰老和细胞凋亡的了解。使用酵母做研究对象的其他好处还包括,它们在实验室培养的成本低廉,许多可直接用于研究的菌株已经商品化。然而,对该生物的正确保存对实验成功极为关键。

本短片将全面讲述如何在实验室培养和保存酿酒酵母。将讲解检测酵母数目扩增所需的一些基本知识,例如使用分光光度计得到生长曲线。本短片还将演示在实验室保存酿酒酵母要用到的实际操作技术,包括培养基的准备,如何开始新的酵母培养,和如何保存菌株。短片最后还将展示将这些操作和保存技术用于科学研究中的例子。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 模式生物I:酵母,果蝇和秀丽线虫. 酿酒酵母的培养和保存. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

细胞周期调控,端粒酶活性和自噬这些在在酿酒酵母中的重大发现证明了它是一个极具研究价值的模式生物。酵母易于培养且其载体和株系都已商品化。尽管培养酵母的费用相对低廉,但对它的保存对实验成功至关重要。本短片会让您深入了解在实验室如何培养和保存酿酒酵母株系。

在生物学上,生长曲线用来描述一定时间内细胞数目的变化。酵母的生长曲线以X轴代表时间,Y轴代表600nm细胞培养物的光密度 或OD值来绘制。光密度或“吸光度”是指光通过酵母细胞悬浮液前后强度比值的对数值。使用分光光度计可以测定特定波长下的光密度。

操作酵母时,酵母株系的生长曲线必须通过测定不同时间间隔的OD值来绘制。酵母生长曲线分为三个主要时期:延滞期,对数生长期和稳定期。在延滞期,细胞适应环境,生长变大但并不分裂。在对数生长期,细胞分裂旺盛而导致细胞数目开始倍增。一旦营养耗尽,酵母细胞进入稳定期后,细胞分裂速度变缓,细胞数目保持恒定。

利用生长曲线,酵母株系的倍增时间可以用以下公式计算:OD1和OD2代表测量的光密度,T1和T2代表两次测量的时间间隔。倍增时间是指细胞数目加倍所需的时间。通过计算两个对数期的OD值,如这里所示的OD值0.2和0.5,野生型酵母的倍增时间约为90分钟。

了解倍增时间的好处在于你能根据它安排你全天的实验进程。

现在我们知道了酵母生长曲线的基本细节。接下来让我们到实验室做一些培养酵母的准备工作。富集培养基也就是酵母粮食的主要成分是:酵母提取物,蛋白胨和糖分。酵母提取物是指去除细胞壁的酵母细胞成分,它提供氨基酸,维生素,碳水化合物和其他生长所需的营养。蛋白胨来源于动物肉类或乳类,是酵母培养基的主要氨基酸来源。糖分通常指葡萄糖,为细胞生长提供能量。

将酵母提取物和蛋白胨溶解于水后,用高压灭菌锅灭菌。加入琼脂到液体培养基中制作酵母平板培养基,将混合物倒入平板,室温凝固后。这些平板可以用来划线酵母获得单克隆。

现在我们已经准备好了培养基,我们要如何从头培养这 些小生物呢?首先也是最主要的,要确保所有器具,溶液和培养基都已灭菌。

然后拿一个平板划线酵母细胞。我们所说的划线是如你在这里看到的使用无菌设备将酵母液体培养物在琼脂板上涂开。在“线”的周围会形成由单个细胞长成的单克隆。可以将其挑出以获得单一遗传特性的酵母细胞。平板划好线后,翻转放置在30度培养箱培养2-3天。30度是酵母生长的最佳温度。

克隆长出来以后,接种酵母细胞到小体积的培养基中。这里接种是指挑单克隆到培养基中稍微混匀,在30度摇床或者旋转器上培养48小时。

大规模培养酵母时,要先用分光光度计测量培养2天的酵母培养物在600纳米的OD值,稀释至起始OD值约为0.1到0.2,然后将三角瓶放入30度摇床培养至想要的OD值。

在学习了如何培养酵母后,下一个重要课程就是学习如何储存酵母以备将来使用。平板培养的酵母可以在4度保存3个月。不过若要得到新鲜培养物,需在接种前在新鲜平板上重新划线细胞。

如要长期保存酵母株系,可分装细胞到含甘油的冻存管。细胞在-80度可保存长达几年。

现在你已经是培养酵母的专家了,让我们来再来看看如何在科学研究中应用这些基本技术。稳定期的细胞可以用于研究衰老过程中调节基因组DNA不稳定性的基因。这个视频片段中我们看到的从三天培养物中收集到的细胞。将他们涂板到正常酵母细胞无法生长的选择培养基上。只有突变了的酵母才能在平板上形成菌落。平板上的菌落数目就是培养物中基因组不稳定性水平的比例。

另一个研究衰老的例子就是通过分析酵母细胞的自然寿命。自然衰老是指单位时间内细胞活力的减少。可通过这里所示的培养液体培养物的方法来研究。在视频里,科学家正在将不同的培养物放在分光光度计上测量来描绘用于检测细胞活力的生长曲线。

对数期的野生型酵母健康正常,可以用于研究真核细胞器,如核糖体。视频中将对数期收集的细胞裂解液上样到梯度蔗糖上。然后离心以沉降核糖体并利用吸光度检测仪来得到核糖体图谱。

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