ホール マウントIn Situハイブリダイゼーション

Developmental Biology

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Summary

全体マウントの in situハイブリダイゼーション (WMISH) は、胚における発現 Rna の場所を視覚化するために使用される一般的な手法です。このプロセスで総合的に生産の RNA プローブが相補的に最初またはバインド、標的遺伝子の転写産物に「ハイブリダイズ」.免疫組織化学または蛍光性、使用されますこれらの RNA の雑種を検出する遺伝子発現の時空間パターンを明らかに。伝統的なその場で交配の技術、計算的に再構築する必要がありますイメージが薄い切片を必要とするのとは異なり全体マウント テクニックは表現パターン全体胚または構造上評価される遺伝子ができます。

全台紙染色と詳細キー操作手順、プローブの設計と生産、胚の固定や染色、ポスト交配信号検出などの基本的な概念を紹介します。視聴者は、どのように発達生物学者について現在の研究に WMISH を適用について説明します。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 発生生物学の必需品. ホール マウントIn Situハイブリダイゼーション. JoVE, Cambridge, MA, (2019).

全体マウントの in situハイブリダイゼーションは、胚発生の分子基盤を理解する科学者を可能にする強力な手法です。「全体-マウント」は、全体の胚を使用することを示しますだけではなく組織のスライス。「その場で」「ポジション」のラテン語の意味は、します。最後に、「交配」は生物の細胞内 mRNA 転写する総合的作り出された RNA 分子の相補的な結合を指します。

このビデオでは、手順、予期された結果、および発達障害のよりよい理解を可能にすることができますこのテクニックの選択したアプリケーションを示します。

生物の形態形成を根底にある遺伝子は萌芽期の開発の過程で空間制限パターンで表現されます。

Riboprobes と呼ばれる、総合的に生産の RNA プローブを使用すると、相補的な結合によって、Mrna を検出します。Riboprobes は、「皮膚」ジニトロフェノール、ビオチン、digoxygenin などを含む特別なヌクレオチドが付いています。皮膚より大きい分子にアタッチしたときに免疫反応を引き出すことができる分子である、したがって抗体の結合のためのターゲットであります。これらの検出の抗体は蛍光または着色された染料が預けられる化学反応を触媒する酵素西洋わさびペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどに抱合します。

伝統的なその場で交配の技術には、内部構造の検出を容易にする胎児のティッシュ セクションの準備が必要があります。その結果、生物全体の遺伝子発現の包括的なアセスメントはコンピューター ソフトウェアの助けを借りて 5-6 μ m の切片から再構築する必要があります。ただし、全部実装技術の発展に伴い、全胚内のより大きい間隔上の遺伝子発現解析を取得できます。

全体マウントの in situハイブリダイゼーションの背後にある原理を見た後、実験的プロトコル手順を行ってみましょう。

この手順の最初の手順には、ターゲット シーケンスに調査するモデル有機体の識別が含まれます。ターゲット dna は RNA ポリメラーゼ開始シーケンスを含むプライマーを用いて PCR によってそれから増幅されます。増幅された DNA テンプレート今ハプテン標識ヌクレオチドの in vitro 転写します。このハプテン標識の riboprobe は、交配のステップの準備が整いました。

胚は、ホルムアルデヒド、タンパク質を安定化し、RNases に対して保護する架橋試薬固定による交配のために用意しています。固定後、ホルムアルデヒドは洗剤、トゥイーンなどの少量を含むリン酸緩衝生理食塩水で胚を数回洗浄することにより削除されます。細胞間脂質を削除し、プローブの組織浸透を容易にするため、胚は、たとえばメタノール洗浄の一連の階級におけるステータス退避済み: 25%、50%、75%、100% メタノール。胚は、-20 ° C で最大 1 ヶ月間 100% メタノール (またはそれ以上) に保存できます。

交配の胚を準備をするには、彼らは徐々 に弱くなりメタノール洗浄あたりメタノール洗浄の一連の階級によって復元する必要があります。胚は、組織への riboprobe の拡散を促進するプロテアーゼ消化されます。胎児にラベル付きの riboprobe が追加され、交配を実施します。

ポスト交配の洗浄は、非特異的な交配を削除する実行されます。不完全な削除する交配、T1 が追加されます RNases A は一本鎖 RNA を消化、プローブします。ハプテン標識 riboprobes を結合する抗体酵素共役で交配させられたプローブが検出されました。前述のように、アルカリホスファターゼのような酵素はハプテン特異的抗体に共役し、色の変化を引き出す酵素の基板を追加することによって検出されます。この例のように、反応生成物は表現された mRNA の位置を示す暗い紫色沈殿物を形成します。

全体マウントの in situハイブリダイゼーションを行う方法を知って、今では、技術のいくつかのアプリケーションを見てみましょう。

全体マウントの in situハイブリダイゼーションは、マラリア、デング熱、西ナイル病などの致命的な蚊媒介性疾患に取り組む科学者を支援に使用されています。蚊再生および開発に関与する遺伝子の特性より良いターゲットの病気を運ぶ蚊に新しい生物学的または化学殺虫剤を設計可能性があります。

このテクニックを別のアプリケーションには、催奇形、または胎児の発育を妨げるエージェントへの露出に関連付けられている遺伝子発現パターン変化の特性評価が含まれます。

ここでは、全体マウントの in situハイブリダイゼーションは、遺伝子発現パターンがアルコールへの暴露後に変更されますを識別するために胎児性アルコール症候群のゼブラフィッシュ モデルで使用されました。これは子宮内でのアルコール暴露の影響を緩和する治療法の開発で助けることができます。

全体マウントの in situハイブリダイゼーションは、先天性疾患に伴う表現型の変化を検証する使用できます。バルデ-ビードル症候群に関連する変異は、総合的作り出された変異体 Mrna によるゼブラフィッシュの胚に導入されました。定義された時間が経過すると、胚は不具合の重大度に基づいてグループに分けられました。遺伝子の発現を可視化する変異遺伝子の下流表現型の変化を検証に使用しました。したがって、表現型の得点との組み合わせでその場で全部マウント交配は発達の欠陥の基になる特定の突然変異の役割の理解を促進できます。

ゼウスの全体マウントの in situハイブリダイゼーションのビデオを見てきただけ。この手法は、生体内で遺伝子発現の時間的・空間的特性を可能にする強力なツールです。全体マウントの in situハイブリダイゼーションは、モデル有機体の多数の開発の間に遺伝子発現パターンのアトラスを生成する現在使用されています。これらの研究は、人間の病気、がんなどを治療する新しい治療法の開発を促進するかもしれない。見てくれてありがとう!

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