Overview
Hibridização in situ (WMISH) é uma técnica comum usada para visualizar a localização de RNAs expressos em embriões. Nesse processo, as sondas RNA produzidas sinteticamente são primeiro complementarmente ligadas, ou "hibridizadas", às transcrições dos genes-alvo. A imunohistoquímica ou fluorescência é então usada para detectar esses híbridos de RNA, revelando padrões espaciais e temporais de expressão genética. Ao contrário das técnicas tradicionais de hibridização in situ, que requerem seções de tecido fino cujas imagens precisarão ser remontadas computacionalmente, a técnica de montagem total permite que padrões de expressão genética sejam avaliados sobre todo o embrião ou estrutura.
Este vídeo introduzirá os conceitos básicos de coloração de montagem inteira e detalhar as principais etapas processuais, incluindo projeto e produção da sonda, fixação e coloração de embriões e detecção de sinal pós-hibridização. Os espectadores aprenderão sobre como os biólogos do desenvolvimento estão aplicando OMISH aos estudos atuais de pesquisa.
Procedure
Hibridização in situ é uma técnica poderosa que permite aos cientistas entender a base molecular do desenvolvimento embrionário. "Montaria inteira" indica que todo o embrião será usado, não apenas uma fatia de tecido. " In situ" é uma frase em latim que significa "em posição". E, finalmente, "hibridização" refere-se à vinculação complementar de uma molécula de RNA produzida sinteticamente a uma transcrição mRNA dentro da célula de um organismo.
Este vídeo demonstrará o procedimento, os resultados esperados e as aplicações selecionadas desta técnica que podem permitir uma melhor compreensão dos distúrbios do desenvolvimento.
Genes subjacentes ao organismo morfogênese são expressos em padrões temporal e espacialmente restritos durante o curso do desenvolvimento embrionário.
Sondas de RNA produzidas sinteticamente, chamadas roupões de costela, são usadas para detectar mRNAs por vinculação complementar. Os roupões são rotulados com nucleotídeos especiais contendo "haptens", como dinitrophenol, biotina ou digoxygenina. Haptens são moléculas que podem obter uma resposta imune quando ligadas a moléculas maiores, e, portanto, são alvos de ligação de anticorpos. Estes anticorpos de detecção são conjugados a enzimas, como peroxidase de rabanete ou fosfattase alcalina, que catalisam reações químicas onde um corante fluorescente ou colorido pode ser depositado.
Técnicas tradicionais de hibridização in situ requerem a preparação de seções teciduais de um embrião para facilitar a detecção das estruturas internas. Como resultado, uma avaliação completa da expressão genética em todo o organismo precisará ser reconstruída a partir das fatias de tecido de 5-6 μm com a ajuda de software de computador. No entanto, com o desenvolvimento de técnicas de montagem integral, a análise da expressão genética em distâncias maiores dentro de todo o embrião pode ser obtida.
Depois de olhar para os princípios por trás da hibridização in situ, vamos passar pelo protocolo experimental passo a passo.
O primeiro passo nesse procedimento envolve a identificação da sequência alvo no organismo modelo a ser investigado. A sequência de DNA alvo é então amplificada por PCR usando primers contendo sequências de iniciação de polimerase RNA. O modelo de DNA amplificado é agora transcrito in vitro com nucleotídeos com rótulo hapten. Este riboprobe com rótulo hapten está agora pronto para a etapa de hibridização.
Os embriões são preparados para hibridização via fixação com formaldeído, um reagente transfronteiriço que estabiliza proteínas e protege contra RNases. Após a fixação, o formaldeído é removido lavando o embrião várias vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato contendo uma pequena quantidade de detergente, como tween. Para remover lipídios celulares e facilitar a penetração da sonda nos tecidos, os embriões são desidratados em uma série de lavagem de metanol, por exemplo: 25%, 50%, 75%, 100% metanol. Os embriões podem ser preservados em 100% de metanol por até um mês (ou mais) a -20°C.
Para preparar embriões para hibridização, eles devem ser rehidratados por uma série de lavagem de metanol com progressivamente menos metanol por lavagem. Os embriões são então digeridos com uma protease para facilitar a difusão de riboprobe nos tecidos. A riboprobe rotulada é adicionada ao embrião e a hibridização é realizada.
As lavagens pós-hibridização são realizadas para remover hibridizações não específicas. RNases A a T1 são adicionadas para remover sondas incompletamente hibridizadas, digerindo RNA de um único fio. As sondas hibridizadas são detectadas com um conjugado de enzima de anticorpos que liga os roupões de costelas com rótulo hapten. Como mencionado anteriormente, enzimas como fosfattase alcalina são conjugadas a anticorpos específicos do hapten, e são detectadas adicionando substratos enzimáticos para provocar uma mudança de cor. O produto de reação forma um precipitado roxo escuro marcando a localização do mRNA expresso, como visto neste exemplo.
Agora que você sabe como fazer a hibridização in situ, vamos olhar para algumas aplicações da técnica.
A hibridização in situ foi usada para ajudar os cientistas a combater doenças mortais transmitidas por mosquitos, como malária, dengue e doença do Nilo Ocidental. Ao caracterizar os genes envolvidos na reprodução e desenvolvimento do mosquito, novos inseticidas biológicos ou químicos podem ser projetados para melhor atingir os mosquitos portadores de doenças.
Outra aplicação dessa técnica envolve a caracterização de mudanças de padrão de expressão genética associadas à exposição a teratogens, ou agentes que interferem no desenvolvimento fetal.
Aqui, a hibridização in situ foi usada em um modelo de zebrafish da síndrome alcoólica fetal para identificar genes cujos padrões de expressão são alterados após a exposição ao álcool. Isso pode ajudar no desenvolvimento de terapias para mitigar as consequências da exposição ao álcool no útero.
A hibridização integral no situ também pode ser usada para validar alterações fenotípicas associadas a doenças congênitas. Mutações associadas à síndrome de Bardet-Biedl foram introduzidas em embriões de zebrafish através de mRNAs mutantes produzidos sinteticamente. Após um período de tempo definido, os embriões foram divididos em grupos baseados na gravidade dos defeitos. Visualizando a expressão dos genes a jusante do gene mutante foi usado para validar as alterações fenotípicas. Assim, a hibridização in situ em conjunto com a pontuação fenotípica pode facilitar uma melhor compreensão dos papéis de mutações específicas subjacentes a defeitos de desenvolvimento.
Você acabou de assistir o vídeo do JoVE em toda a montagem na hibridização situ. Esta técnica é uma ferramenta poderosa que permite caracterização temporal e espacial precisa da expressão genética dentro de um organismo. Hibridização in situ está sendo usada atualmente para gerar um atlas de padrões de expressão genética durante o desenvolvimento em uma infinidade de organismos modelo. Esses estudos podem facilitar o desenvolvimento de novas terapêuticas para o tratamento de doenças humanas, incluindo o câncer. Obrigado por assistir!
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
