Overview
הרכבה מלאה בהכלאה במקום (WMISH) היא טכניקה נפוצה המשמשת להדמיית המיקום של RNAs מבוטא בעוברים. בתהליך זה, בדיקות RNA המיוצרות באופן סינתטי קשורות תחילה באופן משלים, או "היברידיות", לתעתיקים של גני היעד. אימונוהיסטוכימיה או פלואורסצנטיות משמשת לאחר מכן לזיהוי היברידיות RNA אלה, וחושף דפוסים מרחביים וטמפורליים של ביטוי גנים. שלא כמו טכניקות היברידיות מקומיות מסורתיות, הדורשות מקטעי רקמות דקות שתמונותיהם יצטרכו להיות להרכיב מחדש חישובית, טכניקת ההר שלם מאפשרת להעריך דפוסי ביטוי גנים על כל העובר או המבנה.
וידאו זה יציג את המושגים הבסיסיים של כתמי הרכבה שלמה ויפרט את הצעדים הפרוצדורליים העיקריים, כולל עיצוב וייצור של בדיקה, קיבוע והכתמה של עוברים וזיהוי אותות לאחר הכלאה. לאחר מכן הצופים ילמדו על האופן שבו ביולוגים התפתחותיים מיישמים את WMISH במחקרים הנוכחיים.
Procedure
הרכבה מלאה בהכלאה במקום היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת למדענים להבין את הבסיס המולקולרי של התפתחות עוברית. "הר שלם" מציין כי העובר כולו ישמש, לא רק פרוסת רקמה. " במקום " הוא ביטוי לטינישפירושו"בעמדה". ולבסוף, "הכלאה" מתייחסת לכריכה המשלימה של מולקולת RNA המיוצרת באופן סינתטי לתעתיק mRNA בתוך התא של אורגניזם.
וידאו זה ידגים את ההליך, את התוצאות הצפויות, ואת היישומים שנבחרו של טכניקה זו שיכולים לאפשר הבנה טובה יותר של הפרעות התפתחותיות.
מורפוגנזה של אורגניזם שבבסיס בראשית מתבטאת בדפוסים מוגבלים זמנית ומפונית במהלך ההתפתחות העוברית.
בדיקות RNA המיוצרות באופן סינתטי, הנקראות גשושי ריבו, משמשות לזיהוי mRNAs על ידי כריכה משלימה. ריבופרופים מסומנים בנוקלאוטידים מיוחדים המכילים "הפטנים", כגון דיניטרופינול, ביוטין או דיגוקסיגנין. Haptens הן מולקולות שיכולות לעורר תגובה חיסונית כאשר הן מחוברות למולקולות גדולות יותר, ולכן הן מטרות לכריכת נוגדנים. נוגדני זיהוי אלה מצומדים לאנזימים, כגון פרוקסידאז חזרת או פוספטאז אלקליין, המזרזים תגובות כימיות שבהן ניתן להפקיד צבע פלואורסצנטי או צבעוני.
מסורתי בטכניקות הכלאה במקום דורשות הכנת מקטעי רקמות של עובר כדי להקל על זיהוי המבנים הפנימיים. כתוצאה מכך, הערכה מלאה של ביטוי גנים ברחבי האורגניזם יהיה צורך לשחזר מן פרוסות רקמת 5-6 מיקרומטר בעזרת תוכנת מחשב. עם זאת, עם התפתחות של טכניקות הרכבה מלאה, ניתוח ביטוי גנים על פני מרחקים גדולים יותר בתוך העובר כולו ניתן להשיג.
לאחר שנסתכל על העקרונות שמאחורי הר שלם בהכלאה במקום, בואו נעבור על הפרוטוקול הניסיוני צעד אחר צעד.
השלב הראשון בהליך זה כרוך בזיהוי רצף היעד באורגניזם המודל שיש לחקור. רצף הדנ"א של היעד מוגבר על ידי PCR באמצעות פריימרים המכילים רצפי חניכה פולימראז RNA. תבנית הדנ"א המוגברת מתומללת כעת במבחנה עם נוקלאוטידים המסומנים בהפטן. נגן ריבו-פרופור זה, המסומן בתווית האפטן, מוכן כעת לשלב ההכלאה.
עוברים מוכנים להכלאה באמצעות קיבעון עם פורמלדהיד, ריאגנט מקשר חוצה המייצב חלבונים ומגן מפני RNases. לאחר קיבעון, פורמלדהיד מוסר על ידי שטיפת העובר מספר פעמים עם תמיסת מלח חוצצת פוספט המכילה כמות קטנה של חומר ניקוי, כגון Tween. כדי להסיר שומנים תאיים להקל על חדירת בדיקה לתוך הרקמות, עוברים מיובשים בסדרה מדורגת של שטיפות מתנול, למשל: 25%, 50%, 75%, 100% מתנול. עוברים יכולים להישמר ב 100% מתנול עד חודש אחד (או יותר) ב -20 מעלות צלזיוס.
כדי להכין עוברים להכלאה, הם חייבים להיות rehydrated על ידי סדרה מדורגת של מתנול שוטף עם בהדרגה פחות מתנול לכביסה. עוברים מתעכלים לאחר מכן עם פרוטאז כדי להקל על דיפוזיה של ריבופרוב לתוך הרקמות. תוחם ריבופרוב שכותרתו לעובר וההכלאה מתבצעת.
שטיפות לאחר היברידיזציה מבוצעות להסרת הכלאות לא-מדעיות. RNases A T1 מתווספים כדי להסיר בדיקות היברידיות חלקית על ידי עיכול RNA חד-גדילי. הבדיקות ההיברידיות מזוהות עם מצומד נוגדנים-אנזימים הקושר את גשושי הריבו-תות המסומנים בהפטן. כאמור, אנזימים כמו פוספטאז אלקליין מצומדים לנוגדנים ספציפיים להפטן, והם מזוהים על ידי הוספת מצעים אנזימים כדי לעורר שינוי צבע. מוצר התגובה יוצר משקעים סגולים כהים המסמנים את המיקום של ה- mRNA המבוטא, כפי שניתן לראות בדוגמה זו.
עכשיו שאתם יודעים איך לעשות הרכבה מלאה בהכלאה במקום, בואו נסתכל על כמה יישומים של הטכניקה.
הר שלם בהכלאה במקום שימש כדי לעזור למדענים להתמודד עם מחלות קטלניות המועברות על ידי יתושים, כגון מלריה, קדחת דנגי, ומחלת הנילוס המערבי. על ידי אפיון הגנים המעורבים ברבייה ופיתוח יתושים, קוטלי חרקים ביולוגיים או כימיים חדשים עשויים להיות מתוכננים כדי למקד טוב יותר את היתושים נושאי המחלה.
יישום נוסף של טכניקה זו כרוך באפיון של שינויי דפוס ביטוי גנים הקשורים לחשיפה לטרטוגנים, או סוכנים המפריעים להתפתחות העובר.
כאן, הר שלם בהכלאה במקום שימש במודל דג זברה של תסמונת אלכוהול עוברית כדי לזהות גנים שדפוסי הביטוי שלהם משתנים לאחר חשיפה לאלכוהול. זה יכול לעזור בפיתוח של טיפולים כדי למתן את ההשלכות של חשיפה לאלכוהול ברחם.
הרכבה מלאה בהכלאה במקום יכול לשמש גם כדי לאמת שינויים פנוטיפיים הקשורים למחלות מולדות. מוטציות הקשורות לתסמונת ברדט-בידל הוכנסו לעוברים של דגי זברה באמצעות mRNAs מוטנטיים המיוצרים באופן סינתטי. לאחר פרק זמן מוגדר, העוברים חולקו לקבוצות המבוססות על חומרת הליקויים. הדמיית הביטוי של גנים במורד הזרם של הגן שעבר מוטציה שימשה לאימות השינויים הפנוטיפיים. לכן, הר שלם בהכלאה במקום בשילוב עם ניקוד פנוטיפי יכול להקל על הבנה טובה יותר של התפקידים של מוטציות ספציפיות שבבסיס פגמים התפתחותיים.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על כל ההר בהכלאה במקום. טכניקה זו היא כלי רב עוצמה המאפשר אפיון זמני ומרחבי מדויק של ביטוי גנים בתוך אורגניזם. הר שלם בהכלאה במקום משמש כיום ליצירת אטלס של דפוסי ביטוי גנים במהלך הפיתוח במספר רב של אורגניזמים מודל. מחקרים אלה עשויים להקל על פיתוח של טיפולים חדשים לטיפול במחלות אנושיות, כולל סרטן. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
