Whole-Mount In Situ hibridación

Developmental Biology

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Summary

Conjunto de montaje en situ hibridación (WMISH) es una técnica común utilizada para la visualización de la ubicación de RNAs expresadas en embriones. En este proceso, sintéticamente producidas sondas de RNA son primera complementariamente obligado o "cruzado por hibridación," a la transcripción de genes diana. Inmunohistoquímica o fluorescencia se utiliza entonces para detectar estos híbridos de ARN, revelando los patrones espaciales y temporales de la expresión génica. A diferencia de los tradicionales en situ hibridación técnicas, que requieren de secciones del tejido fino cuyas imágenes se necesitan reensamblarse computacionalmente, la técnica de montaje de conjunto permite gene patrones de la expresión a evaluar sobre el embrión entero o estructura.

Este video presenta los conceptos básicos de Monte toda la coloración y el detalle claves procesales, incluyendo el diseño de la sonda y producción, fijación de embriones y tinción y detección de señales de hibridación posterior. Los espectadores aprenderán entonces sobre cómo desarrollo biólogos están aplicando WMISH a estudios de investigación actuales.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la biología del desarrollo. Whole-Mount In Situ hibridación. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Conjunto de montaje en situ el hibridación es una técnica poderosa que permite a los científicos a entender las bases moleculares del desarrollo embrionario. "Whole-mount" indica que el embrión entero se utiliza, no sólo un trozo de tejido. "In situ" es un frase en latín que significa "lugar." Y por último, la "hibridación" se refiere a la Unión complementaria de una molécula de ARN sintético producida a una transcripción de mRNA dentro de la célula de un organismo.

Este video muestran el procedimiento, los resultados esperados y las aplicaciones de esta técnica que puede permitir para una mejor comprensión de los trastornos del desarrollo.

Genes subyacentes morfogénesis del organismo se expresan en patrones restringidos temporal y espacial en el curso del desarrollo embrionario.

Sintéticamente producidas sondas de RNA, llamadas riboprobes, se utilizan para detectar mRNAs complementarios atando. Están etiquetados riboprobes con especiales nucleótidos que contiene "haptenos" como el dinitrofenol, biotina o digoxygenin. Los haptenos son moléculas que pueden provocar una respuesta inmune cuando se ata a las moléculas más grandes y por lo tanto son objetivos para la Unión de anticuerpos. Estos anticuerpos de detección son conjugados a enzimas como la peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina, que catalizan las reacciones químicas donde puede depositarse un colorante fluorescente o de color.

Tradicional en situ hibridación técnicas requieren la preparación de las secciones de tejido de un embrión para facilitar la detección de las estructuras internas. Como resultado, una evaluación completa de la expresión génica en todo el organismo tendrá que ser reconstruido a partir de las láminas de tejido de 5-6 μm con la ayuda de programas informáticos. Sin embargo, con el desarrollo de técnicas de montaje de conjunto, análisis de expresión génica sobre distancias más grandes en el embrión entero pueden ser obtenido.

Después de observar los principios del montaje en conjunto en situ el hibridación, vamos a ir a través del protocolo experimental paso a paso.

El primer paso de este procedimiento consiste en la identificación de la secuencia de destino en el organismo modelo para ser investigado. La blanco de secuencia de la DNA entonces se amplifica por PCR usando las cartillas que contienen secuencias de ARN polimerasa iniciación. Ahora, la plantilla de ADN amplificada se transcribe in vitro con nucleótidos marcados con hapteno. Este riboprobe marcado hapteno está listo para el paso de hibridación.

Los embriones están preparados para hibridación mediante fijación con formol, un cross-linking reactivo que estabiliza proteínas y protege contra RNasas. Después de la fijación, el formaldehído se elimina el embrión se lava varias veces con tampón fosfato salino que contiene una pequeña cantidad de detergente, como interpolación. Para eliminar los lípidos celulares y facilitar la penetración de la sonda en los tejidos, los embriones se deshidratan en una serie gradual de lavados de metanol, por ejemplo: 25%, 50%, 75%, 100% metanol. Los embriones se pueden preservar en metanol al 100% hasta por un mes (o más) a-20 ° C.

Para preparar los embriones para hibridación, deben ser rehidratados por una serie gradual de metanol lavados con progresivamente menos metanol por lavado. Los embriones entonces son digeridos con una proteasa para facilitar la difusión de riboprobe en los tejidos. La etiqueta riboprobe se agrega al embrión y la hibridación se lleva a cabo.

Se realizan lavados de la hibridación para quitar hibridaciones no específicas. RNasas A un T1 se agregan remover incompleto cruzado por hibridación sondas por digerir RNA monocatenario. Las sondas hibridadas se detectan con un anticuerpo-enzima conjugado que se une al hapteno-etiquetados riboprobes. Como se mencionó anteriormente, enzimas como la fosfatasa alcalina están conjugadas hapteno específicos anticuerpos y se detectaron mediante la adición de sustratos enzimáticos para provocar un cambio de color. Producto de la reacción forma un precipitado de color púrpura oscuro marcar la ubicación de los mRNA expresado, como se ve en este ejemplo.

Ahora que sabes todo-Monte hibridación en situ , echemos un vistazo a algunas aplicaciones de la técnica.

Conjunto de montaje en situ el hibridación se ha utilizado para ayudar a los científicos hacer frente a enfermedades letales transmitidas por mosquitos como la malaria, el dengue y la enfermedad de West Nile. Por la caracterización de los genes implicados en el desarrollo y la reproducción de mosquitos, nuevos insecticidas biológicos o químicos pueden estar diseñados para mejor mosquitos de destino la realización de la enfermedad.

Otra aplicación de esta técnica consiste en la caracterización de la expresión génica cambios en los patrones asociados con la exposición a teratógenos, o a agentes que interfieren con el desarrollo fetal.

Aquí, todo Monte en situ el hibridación fue utilizado en un modelo de pez cebra de síndrome de alcoholismo fetal para identificar los genes cuyos patrones de expresión se cambian después de la exposición al alcohol. Esto puede ayudar en el desarrollo de terapias para mitigar las consecuencias de la exposición del alcohol en el útero.

Conjunto de montaje en situ el hibridación puede utilizarse también para validar cambios fenotípicos asociados con enfermedades congénitas. Se introdujeron mutaciones asociadas con el síndrome de Bardet-Biedl en embriones de pez cebra mediante mRNAs mutante producida sintéticamente. Después de un período definido de tiempo, los embriones fueron divididos en grupos basados en la severidad de los defectos. Visualización de la expresión de genes corriente abajo del gen mutado se utilizó para validar los cambios fenotípicos. Por lo tanto, conjunto de montaje en situ hibridación en combinación con calificación fenotípica puede facilitar una mejor comprensión de los roles de mutaciones específicas subyacentes defectos de desarrollo.

Sólo ha visto video en todo montaje en situ hibridación de Zeus. Esta técnica es una poderosa herramienta que permite la caracterización espacial y temporal precisa de la expresión génica dentro de un organismo. Conjunto de montaje en situ el hibridación se está utilizando actualmente para generar un atlas de patrones de expresión génica durante el desarrollo de una multitud de organismos modelo. Estos estudios pueden facilitar el desarrollo de nuevas terapias para tratar enfermedades humanas, incluyendo el cáncer. ¡Gracias por ver!

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