Dichte Gradienten Ultrazentrifugation

Biochemistry

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Summary

Dichte Gradienten Ultrazentrifugation ist eine verbreitete Methode, zu isolieren und reinigen von Biomolekülen und Zelle Strukturen. Diese Technik nutzt die Tatsache, dass in der Schwebe, Partikel, die Dichter als das Lösungsmittel Sediment, werden während diejenigen, die weniger Dichte schwimmt. Ein High-Speed-Ultrazentrifuge wird verwendet, um diesen Prozess zu beschleunigen um Biomoleküle innerhalb ein Dichtegradient trennen, die durch Überlagerung von Flüssigkeiten abnehmender Dichte in einem Zentrifugenröhrchen begründet werden kann.

Das Video deckt die Grundsätze der Dichte Gradienten Ultrazentrifugation, einschließlich eines Verfahrens, das Probenvorbereitung, Schaffung einer Saccharose Farbverlauf, Ultrazentrifugation und Sammlung von fraktionierten Analyten veranschaulicht. Der Anwendungsabschnitt erläutert Isolierung von Multi-Protein-komplexe, Isolierung von Nukleinsäure-komplexe und Trennung mit Cäsium-Chlorid Dichtegradienten.

Dichte Gradienten Ultrazentrifugation ist ein gemeinsamer Ansatz zu isolieren und Zellstrukturen für biochemische Experimente zu reinigen. Die Technik nutzt eine High-Speed- oder ultra, Zentrifuge, um zelluläre Komponenten in ein Dichtegradient zerstörungsfrei zu trennen. Dieses Video beschreibt die Prinzipien der Dichte Gradienten Ultrazentrifugation, bietet ein allgemeines Verfahren mit einem Farbverlauf von Saccharose und bespricht einige Anwendungen.

Anhand der Grundsätze der Ultrazentrifugation und Dichtegradienten beginnen. Eine Suspension enthält Teilchen in einem flüssigen Lösungsmittel. Aufgrund der Schwerkraft heraus Partikel Dichter als das Lösungsmittel Sediment während diejenigen, die weniger dicht als der Lösungsmittel Schwimmer. Je größer die Differenz in der Dichte zwischen Partikel und das Lösungsmittel, desto schneller die Trennung.

Eine Ultrazentrifuge enthält eine Einheit mit dem Namen eines Rotors, der mit sehr kontrollierter Geschwindigkeit dreht, einem starken Gravitationsfeld zu simulieren. In diesem Bereich sind die Unterschiede in der Dichte zwischen Teilchen und dem Lösungsmittel vergrößert.

Die Stärke des Feldes hängt von der Geschwindigkeit der Rotation. Sogar ein kleinen Rotor bei relativ niedriger Drehzahl erzeugen eine Kraft Tausende Male stärker als Schwerefeld der Erde.

Wenn ein Rohr mehrere Flüssigkeiten unterschiedlicher Dichte enthält, halten Zentrifugation sie in separaten Schichten in der Reihenfolge der Dichte, mit der dichtesten Flüssigkeit am nächsten an der Basis. Solch eine Schichtung von mehreren Flüssigkeiten nennt man eine "Dichtegradient." Es gibt zwei Arten. In Schritt Steigungen, abnehmender Dichte von Flüssigkeiten werden sorgfältig an der Spitze aufeinander geschichtet. In kontinuierliche Farbverläufe werden die Flüssigkeiten in unterschiedlichen Anteilen gemischt, so die Dichte reibungslos von der Basis nach oben abnimmt.

Zellulare Organellen können getrennt werden, mit einem Schritt Farbverlauf durch "Isopycnic Dichtegradienten Zentrifugation." Dies ist die einfachste und häufigste Zentrifugation Verfahren.

Dieses Verfahren wird verwendet, um die Zellstrukturen zu trennen. Der Dichter die Organellen, je weiter es steigt-mit Mitochondrien an der Spitze und Nukleinsäuren in Richtung zur Unterseite.

Nun, da Sie die Prinzipien hinter der Technik kennen, schauen wir es im Labor.

Vor Beginn des Verfahrens des Herstellers Geschwindigkeit und Dichte Bewertungen sollte beachtet werden, und der Ultrazentrifuge auf Korrosion überprüft. Dieses Verfahren nutzt einen schwingen-Eimer-Rotor.

Erstens ist das Zellmaterial vorbereitet durch Homogenisierung der Zellen, die releases zerstörungsfrei ihre Organellen. Das Homogenat kann durch vorläufige Lowspeed Zentrifugation, Low-Density-Komponenten entfernen fraktioniert werden. Als nächstes sind die Saccharose-Lösungen bereit.

Saccharose wird in steigenden Mengen, so ist jede Lösung stärker konzentriert und daher Dichter, als die vorhergehende hinzugefügt. Die genaue Dichte der Lösungen hängt die Komponenten getrennt werden, die zwischen Organismen variieren. Die Lösungen sollten Dichte zwischen den Komponenten, die mit der letzten Lösung Dichter als die dichteste Komponente des Analyten getrennt werden müssen. Techniken zur Trennung von Komponenten Dichter als Saccharose, wie Nukleinsäuren, sind in den Anwendungen beschrieben.

Die Saccharose-Gradient wird nun in einem sauberen Zentrifugenröhrchen erstellt. Eine Pipette wird verwendet, um die am höchsten konzentrierte Saccharoselösung erarbeiten. Mit dem Rohr aufrecht die Pipettenspitze ist hoch an der Wand platziert, und die Flüssigkeit verzichtet stetig nach unten. Es ist wichtig, dass der Arbeitsbereich frei von Vibrationen und andere Störungen bleibt.

Nach dem Austausch der Spitze, werden die restlichen Lösungen in der Reihenfolge abnehmender Dichte hinzugefügt. Die Abgabe erfolgt sorgfältig um unterschiedliche Schichten zu bilden und zu vermeiden, mischen. Schließlich etwa einen halben Milliliter der zellularen Probe wird oben auf den Farbverlauf hinzugefügt, und das Rohr wird gewogen. Dies dient zum Abgleich der Gewichtsverteilung, der nächste Schritt des Prozesses.

Zentrifugation sollten so bald wie möglich beginnen. Das Rohr wird in den Rotor, die dann ausgeglichen wird, indem man leere Lösungen von gleichem Gewicht in die Schlitze gegensätzlichen gesetzt. Der Rotor befindet sich in der Ultrazentrifuge und das System versiegelt. Die Temperatur und Rotationsgeschwindigkeit und Uhrzeit sind eingestellt. Typische Werte sind 4 ° C mit einer Kraft von mehr als 100.000 x g für 16 h.

Nach Zentrifugation, das Rohr ist zurückgezogen vom Rotor, kümmert sich um sie aufrecht und ungestört bleibt. Die verschiedenen zellulären Komponenten haben in diskreten Bänder zwischen den Schichten der Lösung fraktioniert. Die Fraktionen können mit einer Spritze gesammelt werden. Abwechselnd, der Boden des Röhrchens kann mit einer feinen, sterilisierten Nadel punktiert und der Abfluss in sterilen Röhrchen gesammelt. Die zellulären Komponenten haben jetzt isoliert worden. Sie können bei-80 ° c gelagert werden

Nun, da wir die grundlegende Vorgehensweise gesehen haben, betrachten Sie einige Anwendungen.

Eine typische Anwendung ist die Isolierung der Multi-Protein-komplexe in pflanzlichen Zellen. In diesem Beispiel werden komplexe zyklischer Elektronenfluss verantwortet von der Thylakoidmembran, die Stelle der Licht-Reaktion bei der Photosynthese isoliert werden. Dieses Verfahren nutzt diskrete Lösungen von 14 bis 45 % Saccharose. Zentrifugation tritt mehr als 100.000 x g 14 h bei 4 ° C.

Da Nukleinsäuren Dichter als Saccharose sind, kann nicht Isopycnic Zentrifugieren sie von Organellen zerstörungsfrei zu trennen.

Eine andere Technik, bekannt als "Rate-zonale Zentrifugation" verwendet wird. Es trennt Organellen, die basierend auf ihrer Sedimentationsraten, die nicht nur auf ihre dichten, sondern auch auf ihre Konformationen abhängen. Eine kontinuierliche Steigung wird verwendet, um die Komponenten, die auf Grundlage dieser Eigenschaft zu trennen.

Die Verfahrensschritte sind ähnlich wie bei Isopycnic Fällen. In diesem Beispiel RNA-Ribosom-komplexe sind isoliert mit einer kontinuierlichen Steigung von 5 % bis 20 %, bei 230.000 x g. Zentrifugation zentrifugiert wird unterbrochen, nach ein paar Stunden Co Niederschlag zu verhindern.

Nukleinsäure-Stränge können auf der Grundlage der Dichte voneinander getrennt werden.

Dies ist da Stränge reich an Guanin und Cytosin Dichter als diese reich an Adenin und Thiamin sind. In diesem Fall kann nicht die Steigung von Saccharose, gemacht werden, weil Saccharose weniger dicht als Nukleinsäuren ist. Stattdessen werden Cäsium-Chlorid Steigungen, in der Regel von 1,65 bis 1,75 g/mL verwendet, da sie ausreichend Dichte und eine niedrige Viskosität haben.

Hier sehen wir Plankton DNA, geläutert, mit einem kontinuierlichen Cäsium Chlorid Farbverlauf. Zentrifugation tritt bei mehr als 1.000.000 x g für 18 h unter Vakuum.

Sie haben nur Jupiters Video auf Ultrazentrifugation mit einer Saccharose Dichtegradient angesehen. Sie sollten jetzt verstehen, wie ein Dichtegradient funktioniert, wie man einen Farbverlauf Schritt konstruieren und zum Laden und betreiben einer Ultrazentrifuge. Danke fürs Zuschauen!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der Biochemie. Dichte Gradienten Ultrazentrifugation. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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