Ultracentrifugación de gradiente de densidad

Biochemistry

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Summary

Ultracentrifugación de gradiente de densidad es una técnica común utilizada para aislar y purificar las estructuras de biomoléculas y células. Esta técnica aprovecha el hecho de que, en suspensión, partículas que son más densas que el disolvente serán sedimento, mientras que aquellos que son menos densas flotarán. Una ultracentrífuga de alta velocidad se utiliza para acelerar este proceso con el fin de separar biomoléculas dentro de un gradiente de densidad, que puede ser establecido por líquidos y disminución de la densidad en un tubo de centrífuga.

El video cubre los principios de la ultracentrifugación de gradiente de densidad, incluyendo un procedimiento que demuestra la preparación de la muestra, creación de un gradiente de sacarosa, ultracentrifugación y colección de analitos fraccionados. La sección de aplicaciones analiza el aislamiento de complejos, aislamiento de complejos de ácidos nucleicos y la separación mediante gradientes de densidad de cloruro de cesio.

Ultracentrifugación de gradiente de densidad es un método común para aislar y purificar las estructuras de la célula para los experimentos bioquímicos. La técnica utiliza una centrifugadora de alta velocidad, o ultra, para separar de manera no destructiva componentes celulares en un gradiente de densidad. Este video describe los principios de la ultracentrifugación de gradiente de densidad, proporciona un procedimiento general mediante un gradiente de sacarosa y analiza algunas aplicaciones.

Vamos a empezar examinando los principios de Ultracentrífugas y gradientes de densidad. Una suspensión contiene partículas en un líquido disolvente. Debido a la gravedad, las partículas más densas que el sedimento solvente hacia fuera mientras que los menos densas que el disolvente flotador. Cuanto mayor sea la diferencia de densidad entre las partículas y el solvente, el más rápido la separación.

Una ultracentrífuga contiene una unidad llamada un rotor, que gira a velocidades muy controladas, simulando un campo gravitacional fuerte. Dentro de este campo, se potencian las diferencias de densidad entre las partículas y el solvente.

La fuerza del campo depende de la velocidad de rotación. Incluso un pequeño rotor a una velocidad de rotación relativamente baja puede crear una fuerza miles de veces más fuerte que el campo gravitacional de la tierra.

Si un tubo contiene varios líquidos de diferentes densidades, centrifugación mantendrán en capas separadas por orden de densidad, con el líquido más denso más cercano a la base. Acodar de varios líquidos se llama un "gradiente de densidad". Hay dos tipos. Gradientes de paso, los líquidos de disminuir densidad son cuidadosamente en capas en la parte superior uno con el otro. En gradientes de continuo, los líquidos se mezclan en proporciones variables, lo que la densidad disminuye suavemente desde la base hacia arriba.

Organelos celulares se pueden separar utilizando un gradiente de paso, a través de la "centrifugación del gradiente de densidad de isopicnica." Este es el procedimiento de centrifugación más común y más simple.

Este procedimiento se utiliza para separar las estructuras celulares. El más denso el orgánulo, cuanto más desciende-con mitocondrias en la parte superior y los ácidos nucleicos hacia la parte inferior.

Ahora que conoces los principios de la técnica, vamos a ver en el laboratorio.

Antes de inicia el procedimiento, anotar calificaciones de velocidad y densidad del fabricante y la ultracentrífuga comprobado para la corrosión. Este procedimiento utiliza un rotor oscilante-cubo.

En primer lugar, el material celular se prepara por homogeneizar las células, que lanza manera no destructiva sus organelos. El homogeneizado se puede fracciona mediante centrifugación a baja velocidad preliminar, quitar componentes de baja densidad. A continuación, se preparan las soluciones de sacarosa.

Sacarosa se agrega en cantidades cada vez mayores por lo que cada solución es más concentrada y por lo tanto, más denso que el anterior. La densidad exacta de las soluciones dependerá de los componentes a separar, que varían entre los organismos. Las soluciones deben tener densidades entre los de los componentes a separar, con la última solución, más densa que el componente más denso del analito. Técnicas para separar los componentes más densos que la sacarosa, como ácidos nucleicos, se describen en las aplicaciones.

Ahora se crea el gradiente de sacarosa en un tubo de centrífuga limpio. Una pipeta se utiliza para elaborar la solución más concentrada de sacarosa. Con el tubo vertical a cabo, punta de la pipeta se coloca alta contra la pared, y el líquido dispensado continuamente hacia abajo. Es importante que el área de trabajo se mantiene libre de vibraciones y otras perturbaciones.

Después de cambiar la punta, las soluciones restantes se agregan en orden decreciente de densidad. Ellos son dispensadas cuidadosamente para formar capas distintas y evitar mezclar. Finalmente, cerca de la mitad de un mililitro de la muestra celular se agrega encima del gradiente, y se pesa el tubo. Esto se usa para balancear la distribución del peso, el siguiente paso del proceso.

Centrifugación debe comenzar tan pronto como sea posible. Se coloca el tubo en el rotor, que luego se equilibra colocando soluciones en blanco de un peso igual en las ranuras de la oposición. El rotor se coloca en la ultracentrífuga y el sistema de sellado. Se fijan la temperatura y velocidad de rotación y el tiempo. Los valores típicos son de 4 ° C con una fuerza de más de 100.000 x g durante 16 horas.

Después de la centrifugación se retira el tubo del rotor, teniendo cuidado de mantenerlo vertical y sin perturbaciones. Los diferentes componentes celulares se fracciona en bandas discretas entre las capas de la solución. Las fracciones se pueden recoger con una jeringa. Alternativamente, la parte inferior del tubo se puede pinchar con una aguja fina, esterilizada y la salida se recoge en tubos estériles. Ahora se han aislado los componentes celulares. Pueden ser almacenados a-80 ° C.

Ahora que hemos visto lo básico, vamos a ver algunas aplicaciones.

Una aplicación típica es el aislamiento de complejos en las células vegetales. En este ejemplo, complejos de flujo cíclico del electrón están siendo aislados de tilacoides, el sitio de la reacción de la luz en la fotosíntesis. Este procedimiento utiliza las soluciones discretas de 14 a 45% de sacarosa. Centrifugación produce más de 100.000 x g de 14 h a 4 ° C.

Porque los ácidos nucleicos son más densos que la sacarosa, centrifugación isopicnica no puede separarlos de organelos manera no destructiva.

Se utiliza una técnica diferente, conocida como "tarifa zonal centrifugación". Separa organelos basados en sus tasas de sedimentación, que dependen no sólo sus densidades, sino también en sus conformaciones. Un gradiente continuo se utiliza para separar los componentes basados en esta propiedad.

Las etapas del procedimiento son similares a los casos isopicnica. En este ejemplo, los complejos de RNA ribosoma están aislados usando un gradiente continuo de 5% a 20%, se centrifugó a 230.000 x g. centrifugación se interrumpe después de unas horas para evitar la precipitación.

De ácido nucleico puede ser separado entre sí en base a la densidad.

Esto es porque las cadenas ricas en guanina y citosina son más densas que aquellas ricas en adenina y tiamina. En este caso, no se hace el gradiente de sacarosa, porque la sacarosa es menos densa que los ácidos nucleicos. En cambio, se utilizan gradientes de cloruro de cesio, de 1,65 a 1,75 g/mL, ya que tienen suficiente densidad y baja viscosidad.

Aquí vemos a plancton ADN se purificaron usando un gradiente de cloruro de cesio continua. Centrifugación se produce a más de 1.000.000 x g para 18 h bajo vacío.

Sólo has visto video de Zeus en ultracentrifugación con un gradiente de densidad de sacarosa. Ahora usted debe entender cómo funciona un gradiente de densidad, cómo construir un gradiente de paso y cómo cargar y operar una ultracentrífuga. ¡Gracias por ver!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la bioquímica. Ultracentrifugación de gradiente de densidad. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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