Espectrometría de masas MALDI-TOF

Biochemistry

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Summary

Ionización de la desorción del laser asistida por matriz (MALDI) es una fuente de iones espectrometría de masas ideal para el análisis de biomoléculas. En lugar de radiaciones ionizantes compuestos en estado gaseoso, las muestras son embebidas en una matriz, que es golpeada por un láser. La matriz absorbe la mayoría de la energía; entonces algo de esta energía se transfiere a la muestra, que se ioniza como resultado. Los iones de la muestra pueden identificarse entonces con un analizador de tiempo de vuelo (TOF).

Este video cubre principios de MALDI-TOF, incluyendo selección de matriz y cómo TOF se utiliza para aclarar relaciones masa / carga. Este procedimiento muestra la preparación de una placa MALDI, la carga de muestras en la placa y la operación del espectrómetro de masas TOF. En la sección final, aplicaciones y variaciones se muestran, incluyendo análisis de celulares, caracterización de muestras biológicas complejas e ionización del electrón spray.

Ionización de desorción láser asistida por matriz MALDI, es una fuente de iones espectrometría de masas ideal para el análisis de biomoléculas. Más fuentes de iones quitar información estructural de biomoléculas grandes, frágiles. MALDI mantiene la integridad estructural y por lo tanto información, aceleración de las moléculas en el analizador de masas, que separa los compuestos basados en el tamaño y la carga. El más comúnmente junto con MALDI es el tiempo de vuelo o TOF, analizador de la masa. Este video le mostrará los conceptos de MALDI ionización, un procedimiento general y algunas de sus aplicaciones en bioquímica.

Para espectrometría de masas a función, deben ser ionizadas las moléculas en estado gaseoso. En MALDI, la muestra está incrustada en una matriz, normalmente un orgánico compuesto que contienen aromáticos y conjugado enlaces dobles.

Cuando un pulso de láser esta mezcla la matriz absorbe la mayoría de la energía, rápidamente se calienta y es desorbida o liberado, de la superficie. La matriz de energía transfiere algo de su energía a las biomoléculas, desorbing y luego les ionizante.

MALDI se empareja típicamente con un tiempo de vuelo o TOF, analizador de la masa. Un campo eléctrico se aplica energía cinética a los iones, moviéndose en una región libre de campo llamada tubo de la deriva. La velocidad de los iones como se mueven a través del tubo está relacionado con su relación masa / carga, para que partículas más pesadas viajan más lentamente a través del instrumento. Un detector en el extremo del tubo mide el tiempo de vuelo de cada ion. Con este conocimiento, así como la longitud del tubo y la fuerza de campo aplicado, la relación masa / carga de cada ion puede ser aclarada.

Esta parcela de la intensidad de la señal a masa-de-carga-ratio, conocido como espectro de masa, puede ser comparado con una biblioteca de espectros recogidos. Si no encuentra ninguna coincidencia, puede las moléculas pueden ser identificados por otras técnicas, como la espectrometría total en tándem. Para obtener más información, vea el vídeo de la colección sobre el tema.

Ahora que se han discutido los fundamentos de la MALDI-TOF, veamos el proceso en el laboratorio.

Antes de comenzar un experimento, es importante considerar la elección de la matriz de que muestras se ser desorbidas. Debe absorber la energía del láser, sea estable en el vacío, no reaccionan con las moléculas blanco y ser capaces de desorción. Dependiendo de la muestra, se prefieren los diferentes matrices. Para una proteína grande, una combinación de CHCA y DHB ha demostrado mejor separación de los picos, llamado resolución, que las matrices individuales.

Hay un número de maneras de preparar las muestras. Mostraremos lo que se conoce como la "doble capa" o "sandwich", método. Para empezar, limpie la placa MALDI con reactivos ultra puras, como la espectrometría de masas es muy sensible a la contaminación. Secar la placa con una corriente de gas inerte.

A continuación, una solución saturada de la matriz se hace típicamente con un disolvente orgánico. La solución se trata la placa MALDI y se seca. Una segunda solución saturada de matriz que contienen ácido trifluoroacético, TFA, está preparada. TFA ayuda a los iones en la fase gaseosa.

A continuación, se agrega la solución de la muestra sobre el lugar de secado de la matriz. Añadir la solución de la matriz que contiene TFA encima de la muestra, de tal modo completar la matriz de "sandwich". Homogeneidad del punto puede ser verificado bajo un microscopio de baja potencia.

Un estándar de calibración, que es una mezcla con una amplia gama de masas conocidas y se utiliza para correlacionar el tiempo de vuelo de m/z de la placa. Por último, la placa de la matriz sola como control negativo.

Para analizar los puntos, coloque la placa de la blanco en el instrumento. No Asegúrese de residuos presentes, lo que permite la formación de un vacío apretado. En el software, seleccione el control estándar, negativo y muestras de interés. Los puntos con la correcta identificación de la etiqueta.

Los voltajes de la fuente y la lente de ion pueden ser manipulados para mejorar el rendimiento del análisis. Esto dependerá de las características del instrumento y la muestra. En el lugar estándar y calibrar el instrumento con el software.

A continuación, recoger espectros de cada uno de los puntos de muestra. Pruebe algunos lugares diferentes en el mismo lugar para maximizar la calidad de los datos recogidos. Una vez terminado, la placa MALDI puede ser recogida y reutilizada después de la limpieza.

Ahora que hemos revisado un procedimiento, Veamos algunas de las maneras que MALDI se utiliza y una técnica de ionización diferentes.

Además de biomoléculas, MALDI puede utilizarse para analizar las células vivas. Los macrófagos son las células inmunes que toman una de varias formas diferentes, basadas en su microambiente. Después de exponer las células a varios señalización moléculas, o citoquinas, pueden ser añadidos directamente a la placa y analizados. Los espectros MALDI pueden utilizarse como únicas "huellas digitales", dependiendo de la citocina utilizado.

Muestras biológicas complejas como las secreciones sebáceas mamíferas requieren un paso de purificación antes del análisis MALDI. Cromatografía en capa fina es una tal técnica que depende de la polaridad de los componentes. Los compuestos son recogidos desde la coronilla de TLC, purificados y transferidos a una matriz MALDI. Los espectros resultantes verificar la identidad y pureza de las biomoléculas separadas de las secreciones sebáceas mamíferas.

Otra fuente de ion común por biomoléculas es ionización electrospray ESI. En este método, la muestra se inyecta en el instrumento, donde se aplica un alto voltaje, creando un aerosol de gotas cargadas. Como se evapora el solvente en la gota, la carga se mueve a las moléculas de la muestra, hasta que son completamente gaseosos. ESI no requiere el procedimiento de localización, y la muestra se puede inyectar directamente en el instrumento. Por otro lado, ESI es más sensible a la presencia de componentes buffer y otros contaminantes, MALDI es más robusto.

Sólo has visto video de Zeus en espectrometría de masas MALDI. Este video describe la teoría detrás del instrumento, fue un procedimiento general y cubre algunos de los usos de la técnica. ¡Gracias por ver!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la bioquímica. Espectrometría de masas MALDI-TOF. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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