Gebruik van Rotorod als een methode voor de kwalitatieve analyse van Wandelen in Rat

Summary

De rotorod test wordt gebruikt om motor-status te beoordelen in de loopbeweging van hemi-Parkinson ratten analoog.

Abstract

De rotorod test, waarin dieren lopen op een roterende trommel, wordt op grote schaal gebruikt om de motor status te beoordelen in het laboratorium knaagdieren. Prestaties worden gemeten met de duur van een dier blijft op de trommel als een functie van de trommel snelheid. Hier hebben we melden dat de opdracht een rijke bron van informatie over de kwalitatieve aspecten van het lopen bewegingen zorgt. Omdat de bewegingen worden uitgevoerd in een vaste locatie, kunnen ze gemakkelijk worden onderzocht met behulp van high-speed video-opname methoden. De huidige studie werd uitgevoerd om het potentieel van de rotorod om kwalitatieve veranderingen zien in de wandel-bewegingen van hemi-Parkinson ratten analoog, geproduceerd door middel van injectie van 6-hydroxydopamine (6-OHDA) in de rechter nigrostriatale bundel naar nigrostriatale dopamine afbrekende stoffen (te onderzoeken DA ). Vanaf de dag na de operatie en vervolgens periodiek gedurende de komende twee maanden, de ratten werden gefilmd vanuit frontaal, lateraal, en posterieure beschouwt als ze liepen op de rotorod. Gedrag werd geanalyseerd door frame-by-frame herhaling van de video-opnamen. Schalen te stappen gedrag aangegeven dat het hemi-Parkinson ratten chronisch waren aangetast in hun houding en in het gebruik van de ledematen contralateraal van de DA-uitputting. De contralaterale ledematen niet alleen weergegeven houdings-en beweging afwijkingen, namen ze deel minder in het initiëren en onderhouden van voortstuwing dan heeft de ipsilaterale ledematen. Deze bevindingen niet alleen onthullen nieuwe tekorten secundair aan eenzijdige DA-uitputting, maar laten ook zien dat de rotorod kan een krachtig instrument voor de kwalitatieve analyse van de beweging te geven.

Protocol

Rotorod lopen apparatuur

De rotorod was een roterende cilinder, 4 cm in diameter, vaste 35 cm boven de grond en ingesloten door transparant plexiglas. De rotorod cilinder was bedekt met getextureerd rubber coating, die de tractie vergemakkelijkt. De vloer van het apparaat was bedekt met een laag schuim om blessures te voorkomen wanneer dieren viel. Een kleine elektromotor die stroom naar de rotorod draaien via een rubberen band. De rotorod was ingesteld om een ​​keer te draaien om de 5 s.

Video-opnamen en kinematica

Een high-speed digitale video camera werd gebruikt om de dieren film, met behulp van een sluitertijd van een 1000 van een seconde. De voorkant, zijkant en achterzijde uitzicht werden gefilmd terwijl het dier liep op de rotorod. Een twee-arm Nikon, MII koude lichtbron en een set van glasvezel lampen werden gebruikt om adequate verlichting te bieden tijdens het opnemen. De tapes werden geanalyseerd frame-by-frame met behulp van een Sony DSR 20 DV CAM deck. Videobeelden werden vastgelegd met behulp van een frame grabber en Macintosh-computer.

Testprocedure en analyses

Met het oog op de verschillen tussen de bewegingen lopen van de 6-OHDA en controle ratten te evalueren, de video-opnamen van post-operatieve dag 15 - waren 30 (na een herstel van het letsel zou kunnen worden naar verwachting grotendeels afgerond) onderzocht door twee onafhankelijke waarnemers blind voor de experimentele omstandigheden. De nigrostriatale 6-OHDA laesie werd geïnduceerd in de rechter hersenhelft, wat resulteert in een duurzame waardeverminderingen in de linker voor-en achterpoten. A rating schaal werd ontwikkeld om te beoordelen de ratten 'houding en de intensivering bewegingen van de voorpoten (Whishaw et al.., 2003). Vijf componenten van stappen werden beoordeeld:

1. houding, was de beoordeling van de houding van het onderzoeken van de positie van de rat op de trommel;
2. lift en de verspreiding, het gedeelte van de tijdelijke cyclus waarin de poot werd opgeheven uit de trommel;
3. dragen, het gedeelte van de tijdelijke cyclus waarin de ledemaat werd gehouden boven de trommel als de rat naar voren;
4. vooraf, het gedeelte van de te bereiken waarin de ledemaat werd uitgebreid tot weer contact met de trommel, en
5. plaatsing, waarbij de poot weer werd geplaatst op de trommel.

De volgende criteria werden gebruikt om een ​​normale beweging te definiëren:

• Houding: Het lichaam van de rat was gericht op de trommel met het hoofd hielden.
• Lift en laat: de schouder, elleboog en pols zijn gebogen het verhogen van de poot van het oppervlak van de trommel.
• Carry: De poot wordt gehouden boven het oppervlak van de trommel, zijn de cijfers losjes gebogen, en het cijfer tips zijn gericht op de middellijn van het lichaam. Advance: De ledematen wordt naar voren uitgebreid met de cijfers overgang van een semiflexed positie om een ​​uitgebreid en open positie.
• Plaatsing: Het onderdeel is uitgebreid op de schouder, elleboog en pols en de cijfers worden geopend om de poot plaats naar voren en op het oppervlak van de trommel, met cijfer 2 (tweede cijfer van de middenlijn) gelegen op ongeveer het midden van de rat lichaam.

Elke beweging werd beoordeeld op een 3-puntsschaal: 1 = / de beweging leek op die van een controle rat, 0,5 = / de beweging schijnt licht afwijkend, en 0 = / de beweging was duidelijk afwijkend (Whishaw et al., 2003.). Deze rating schaal werd vervolgens gebruikt om vijf stappen bewegingen van elke rat op postoperatieve dag 1, 3, 5, 7, 9 en 15 te evalueren. De scores van de vijf maatregelen werden gemiddeld voor elke rat op elke dag, en de resultaten onderworpen aan een ANOVA met dagen als een herhaald te meten.

Overzicht van de rotorod wandelen in 6-OHDA en controle ratten

De beweging schaal werd toegepast op de postoperatieve testsessies voor kwalitatieve bewegingsanalyse. Tijdens de testsessies, de 6-OHDA laesie groep kreeg significant lagere scores dan heeft de controle groep, F (1,8) = 33,2, p <0,001, maar er was geen significant effect van Test Day, noch was er een aanzienlijke groep door Test Day interactie. De scores van de stappen werden vervolgens afzonderlijk geanalyseerd met de voorpoot als een variabele (voor de 6-OHDA ratten de voorpoot contralateraal van het letsel ten opzichte van de voorpoot ipsilaterale aan de laesie, want de controle ratten, de linker poot versus de rechter poot). Er was een significant effect van de voorpoot, F (1,40) = 15.8, p <0,01, en er was een significante interactie van de groep door de voorpoot, F (1,40) = 15.0, p <0,01. Follow-up t-tests bleek dat de contralaterale-to-laesie voorpoot van de 6-OHDA groep significant lager scoort dan de ipsilaterale-to-laesie voorpoot of de voorpoten van de controle ratten, die niet verschillend ontvangen. Om te bepalen welke onderdelen van de beweging hebben bijgedragen aan de slechte scores verkregen door de 6-OHDA groep, de maatregelen van de houdingen de individuele componenten van de tijdelijke cyclus van de ipsilaterale en contralaterale voorpoten van de 6-OHDA groep werden vergeleken met de waarden verkregen uit de controle ratten. De 6-OHDA groep verschilden in houding en alle componenten van de intensivering van de contralaterale ledemaat, maar geen van de componenten van de ipsilaterale ledemaat (p <0,05).

Kwalitatief en beschrijvend van verschillen in de houding in de hand en 6-OHDA ratten

In een controle rat, het hoofd is gehouden in een horizontale positie, en de ondersteunende voorpoot en de achterpoten straddle de trommel de vorming van een ondersteunende boog. De 6-OHDA ratten meestal liep met de kop naar beneden met hun verminderde voorpoten (tegenover de kijker) dichter bij elkaar geplaatst en hoger op de drum oppervlak dan zich voor het ipsilaterale ledematen of de ledematen van de controle ratten (zie video voor een controle rat met score "1" voor houding, en een 6-OHDA laesie dier met een score van "0"). Meestal kan de afwijking in de houding te zien in een oogopslag van de relatieve positie van het hoofd van een rat.

Voorpoot stepping

In de controle-sequentie, is de intensivering voorpoot opgetild door het buigen van de schouder, elleboog en pols. Omdat de ledematen is opgeheven, worden de cijfers losjes gebogen en de ledematen is opgeheven ruim boven het oppervlak van de trommel. Als de ledematen is gevorderd, wordt hij verlengd op de schouders, elleboog en pols en als het wordt geplaatst de cijfers worden uitgebreid en open. In vergelijking met de controle ratten, de amplitude van alle componenten van het DA-uitgeputte ratten contralateraal van laesie ledematen is verzwakt. De ledemaat releases de trommel later, wordt opgeheven minder, en is geavanceerd een kortere afstand dan is de controle voorpoot. Bovendien, als het been wordt opgetild, worden de cijfers gebogen meer, en als het onderdeel is geplaatst, de cijfers worden uitgebreid en opende minder dan die van een controle rat. De controle voorpoot is opgeheven, zodra zij tot de top van de trommel, is de pols gebogen om de poot omhoog en naar voren, en de pols wordt verlengd als het onderdeel vooruitgang. Daarentegen, de 6-OHDA rat contralateraal van laesie voorpoot wordt verder caudaal gedragen door de beweging van de trommel, en dus releases later met de pols nog steeds uitgebreid. Flexie van de pols lijkt te zijn passief en doet zich voor als de cijfers worden naar achteren gedragen door de beweging van de trommel, en wanneer de voorpoot naar voren wordt gebracht, de poot en de onderarm niet duidelijk opgetild oppervlak van de drum. De voorpoot van een controle rat tot ver naar voren en de cijfers te openen als het ledemaat vooruitgang. Aangezien het ledemaat wordt geplaatst, wordt het geplaatst met een arpeggio beweging, met cijfer 5 contact op te nemen het oppervlak van de drum, gevolgd door achtereenvolgens cijfers 4, 3, en 2. Daarentegen is het onderdeel van de 6-OHDA rat opgetild en uitgebreid minder, de cijfers worden verlengd minder, en ze contact opnemen met het oppervlak van de drum bijna gelijktijdig met een 'klap'. De video toont voorpoot stappen bewegingen in een controle dieren die werden gescoord als "1", en voorpoot stap bewegingen in een 6-OHDA laesie dier dat voornamelijk werden gescoord als "0".

Hind ledematen stepping

Waren er ook stoornissen in de contralaterale-to-laesie achterpoten van de 6-OHDA ratten. Als de controle achterste ledematen beweegt naar achteren lijkt te duwen tegen de draaiende trommel en als het dat doet, de tenen naar buiten draaien. Terwijl de ledematen naar voren beweegt, is de voet naar buiten zwaaide. De achterste ledematen van de 6-OHDA rat beweegt direct achteruit met drum rotatie en als er iets, draait iets naar binnen. Terwijl de ledematen naar voren beweegt, is de voet direct overgedragen. De voet van de controle-rat zwaait naar buiten en als het is gevorderd, de tenen worden gehouden hoger dan de enkel en de tenen uit te breiden. Tijdens de controle rat plaatsing, teen 5 contacten het oppervlak van de drum eerste en het gewicht wordt verdeeld over de tenen en palm. In tegenstelling, zijn de tenen van de 6-OHDA rat gebogen tijdens het vervoeren en plaatsen van wordt gemaakt zonder een arpeggio beweging. De tenen van de controle ratten worden vrijgegeven in een omgekeerde arpeggio patroon zoals teen 5 wordt eerst opgeheven en teen 1 wordt opgeheven laatste. Deze beweging werd vermist in de 6-OHDA laesie rat, terwijl de enkel bleef bij haar gebogen houding tijdens het dragen beweging. Opnieuw de opmars bewegingen van de 6-OHDA rat zijn verzwakt, met de ledematen minder exorotated, tilde minder, en geavanceerde minder dan dat van de controle rat. Als controle ratten plaatsen hun tenen, zijn ze uitgebreid en geopend, zodanig dat de teen 5 punten lateraal ten opzichte van het lichaam van de rat. Toe 5 contact op met de trommel eerst gevolgd door de resterende tenen zodanig dat de rat zijn gewicht ondersteund op de teen tips. Voor de 6-OHDA rat, de tenen enigszins gebogen omdat de voet is overgedragen, de tenen zijn lager aan horizontale ten opzichte van de enkel, is er minder opening van de tenen wanneer de voet wordt geplaatst op de trommel. Paslengte is ook enigszins korter dan die van de controle ratten. Om de verschillen tussen de cont kwantificerenrol en 6-OHDA achterste ledematen bewegingen, de componenten van de lift en release, dragen, promotie, en de plaatsing werden beoordeeld op een 3-punts schaal, net als de voorpoten. De maatregelen werden gemaakt van video-opnamen gemaakt op post operatieve dag 20, en drie stappen cycli werden beoordeeld voor elke rat. Er waren significante verschillen, F (1,8) = 47,6, p <0,001. Follow-up t-toetsen op de onderdelen is aangegeven dat alle onderdelen van de controle ratten significant hogere scores ontvangen dan heeft de componenten van de 6-OHDA ratten. De video toont achterste ledematen stap bewegingen in een controle dieren die werden gescoord als "1". Hind ledematen stap bewegingen in de 6-OHDA aangegeven in de video waren vooral gewaardeerd met een score van "0".

Discussion

Het doel van deze studie was om te onderzoeken of de rotorod test voor knaagdieren voortbeweging vaardigheid kan worden gebruikt voor het kwalitatieve onderzoek van de houding, voorpoot stepping en achterste ledematen intensivering in het zenuwstelsel gewond ratten. Voor de analyse, ratten met een unilaterale DA depleties en controle ratten werden opgenomen video vanaf de voorzijde, laterale en achterste uitzicht. A rating schaal van houding en bewegingen voorpoot aangegeven dat het intensiveren van bewegingen chronisch werden na de operatie verminderd. Onderzoek van de ledematen bewegingen aangegeven dat, terwijl de DA-uitgeputte ratten zou kunnen gebruiken de ledematen contralateraal van de laesie voor ondersteuning, ze minimaal gebruik ontvangen voor het verschuiven van het gewicht. De resultaten van dit onderzoek geven aan dat de rotorod taak, naast het verstrekken van kwantitatieve metingen van motorische stoornissen, kan ook inzicht geven in de kwalitatieve beperkingen.

De rotorod taak is op grote schaal gebruikt voor de beoordeling van de motorische status van de knaagdieren. Tot op heden is de belangrijkste maatregel uit de taak zijn eindpunt maatregelen, maatregelen van de snelheid / duur dat een dier in staat is om te lopen. We voelden dat er kenmerken van de taak die we kunnen maken het ideaal voor de kwalitatieve onderzoek van het lopen bewegingen. Ten eerste, omdat een dier moet balans stap, en de taak houdt grote vaardigheid en kan dus laten zien stoornissen die niet zichtbaar zijn in eenvoudigere taken van bovengrondse beweging (Schallert et al., 1992;. Olsson et al., 1995;. Chang et al.. , 1999; Muir en Whishaw1999b; Metz et al., 2005).. De gevoeligheid van deze taak en de video-analyse-methode is aangetoond door de aanwezigheid van stoornissen in acute en chronische fase na het letsel. Ten tweede, dieren moeten niet worden voedsel of water verstoken om gedrag te motiveren, zoals vereist voor de studie van geschoolde voorpoot te bereiken (Miklyaeva et al., 1994).. Ten derde, de taak vereist minimale training. Bijvoorbeeld, we waren in staat om stap bewegingen film zodra het dier werd geplaatst in het apparaat. Ten vierde, omdat het dier op zijn plaats blijft en de verhoging, is het gemakkelijker om video op te nemen bewegingen uit verschillende invalshoeken. Ten vijfde, de analyse methode maakt het mogelijk de evaluatie van de kwalitatieve aspecten van het lopen bewegingen met eenvoudige classificatiesystemen. De rating systemen produceren betrouwbare resultaten, zelfs in een opname volgorde van een dier en zijn dus tijd-efficiënt voor de experimentator.

Door het ontwikkelen van een eenvoudige 3-punts waarderingsschaal van houding, en voor de vier componenten van de tijdelijke cyclus (lift, dragen, vooraf, en plaats) was het mogelijk om stoornissen te identificeren in de contralaterale-to-laesie ledematen van de DA-uitgeputte ratten zo vroeg als een dag na de operatie. De bijzondere waardevermindering verscheen chronische omdat de bijzondere waardevermindering was gelijk op 15 dagen na de operatie, en ook in informele tests van een aantal maanden na de operatie. Hoewel onze maatregelen zijn afgeleid uit maar liefst vijf stappen cycli per rat, de bijzondere waardevermindering was voldoende robuust te identificeren van een enkele stap cyclus zowel in de voorpoten en achterpoten. De bijzondere waardevermindering in het gebruik van de ledematen werd ook duidelijk in de houding van de dieren, zodat een eenvoudige controle van de houding van het dier zou kunnen uitwijzen dat die een bijzondere waardevermindering had.

Een aantal eerdere studies hebben gewezen op de bron van de bijzondere waardevermindering in de ledematen van de 6-OHDA laesie dieren (Miklyaeva et al., 1995;. Morrissey et al., 1989;. Muir en Whishaw, 1999a;. Schallert et al., 1979). De verminderde ledematen zijn in staat om het lichaamsgewicht en de geallieerde reflexen nodig is om houding te handhaven ondersteuning aanwezig zijn. Zo dieren zijn in staat om op te staan ​​de ledematen, en ze brace tegen pogingen om ze te verdringen. De ledematen worden gebruikt om de houding te ondersteunen herwinnen, wanneer steun verloren. Zo dieren stap of hop te ondersteunen terug te krijgen als ze verliezen hun evenwicht. Tijdens het lopen of het draaien, de ledematen deelnemen aan stappen, maar alleen wanneer de dynamiek van het dier verplaatst de ledematen van haar rol in de houding te ondersteunen. Zo werden, tijdens bovengrondse beweging de unilaterale laesie dier 'hinkt' als een gestoorde ledematen-up te vangen als voorwaartse beweging van het dier verdringt de ledematen van de lichaamshouding te ondersteunen. Bij het draaien, het dier draait op zijn verminderde achterste ledematen bij het draaien ipsilateraal aan de verminderde ledematen, en het 'valt' bij het draaien contralateraal van de verminderde achterste ledematen te verdrijven uit zijn ondersteunend optreden. We waren in staat om zeer vergelijkbaar bijzondere waardeverminderingen, het gewicht te ondersteunen, maar niet het gewicht in acht verschuiven, in de contralaterale-to-laesie ledematen van de ratten die unilaterale 6-OHDA laesies ontvangen als ze liepen op de trommel. Hoewel zowel de voorpoot en de achterste ledematen werden gebruikt voor posturale steun, noch ledematen bleek te zijn gebruikt om gewicht te schakelen. Zo werden zowel de voorpoot en de achterste ledematen opgetild uit de trommel veel later dan zich voor het onverkort ledematen, of de ledematen van de controle ratten. Wanneer de beweging van de trommel de ledematen ontheemd zijn de ondersteunende functies, hun voorwaartse beweging was verzwakt, het verplaatsen alleen de nodige afstand tot het lichaamsgewicht te ondersteunen. Noch de impaired voorpoot noch de achterste ledematen verscheen aan de body lift voldoende, zodat de paar mate zou kunnen swing uit de buurt van de drum oppervlak. De ledematen deed ook niet deel te nemen aan het verschuiven van de ratten 'gewicht naar voren. Bijvoorbeeld, terwijl de achterpoten onderdeel van controle ratten ontvoerd en duwde tegen de trommel om het dier voort te stuwen, hebben de ratten te maken soortgelijke bewegingen met hun verminderde achterste ledematen.

We waren ook in staat om een ​​aantal nieuwe features van de rat stepping bewegingen en dus nieuwe stoornissen te observeren in de manier waarop de DA-uitgeputte ratten verhuisden hun verminderde ledemaat. Zowel de voorpoot en de achterste ledematen contact op met de drum oppervlak met een arpeggio beweging waarbij de buitenkant cijfer (cijfer 5) contact op met de drum oppervlak eerst, gevolgd door achtereenvolgens cijfers 4, 3, en 2. De verminderde voorpoot en de achterste ledematen bleek niet dezelfde te lokaliseren en te anticiperen op de drum oppervlak, en dus contact op met de oppervlakte met een vlakkere palm-neergaande beweging. Een soortgelijke arpeggio beweging is beschreven in het voorpootje van ratten als ze plaatsen hun voorpoten om voedsel (Whishaw en Gorny, 1994) grijpen, en deze beweging wordt ook verminderd door de verminderde onderdeel van DA-uitgeputte ratten (Miklyaeva et al.., 1994 ). Samengevat, de resultaten van de huidige studie geven aan dat dat de rotorod kan een zeer nuttige manier van onderzoeken houding en intensivering in de hersenen gewond ratten te bieden. De taak vraagt ​​balancing en geschoolde stap bewegingen, vereist een minimale training, geen voedsel motiverende beloning, en is gemakkelijk om te scoren en film. Bovendien, bijzondere waardeverminderingen waargenomen op de rotorod kan worden gegeneraliseerd naar andere test situaties.