השימוש Rotorod כשיטה לניתוח איכותי של הליכה עכברוש

Summary

המבחן rotorod משמש כדי להעריך את מצב המנוע בתנועת הליכה של חמי פרקינסון חולדות אנלוגי.

Abstract

המבחן rotorod, שבו בעלי חיים ללכת על תוף מסתובב, נעשה שימוש נרחב על מנת להעריך מצב המנוע מכרסמים במעבדה. הביצועים נמדדת לפי משך הזמן כי חיה נשאר על התוף כפונקציה של מהירות תוף. כאן אנו מדווחים כי המשימה מספקת מקור מידע עשיר על היבטים איכותיים של תנועות ההליכה. בגלל התנועות מבוצעות במיקום קבוע, הם יכולים בקלות לבדוק באמצעות במהירות גבוהה שיטות הקלטה וידאו. המחקר הנוכחי נערך כדי לבחון את הפוטנציאל של rotorod כדי לגלות שינויים מהותיים בתנועות הליכה של חמי פרקינסון חולדות אנלוגי, המיוצר על ידי הזרקה של hydroxydopamine-6 ​​(6 OHDA) לתוך הצרור nigrostriatal הזכות לרוקן nigrostriatal דופמין (DA ). החל הניתוח לאחר יום ולאחר מכן באופן תקופתי על החודשיים הבאים, את החולדות צולמו מתצוגות חזיתית, לרוחב, ואת האחורי כשצעדו על rotorod. התנהגות נותח על ידי החוזר מסגרת לפי מסגרת של רשומות וידאו. סולמות דירוג של דריכה התנהגות ציינו כי חמי פרקינסון חולדות היו לקויי כרוניים בתנוחה שלהם ואת השימוש של הגפיים הנגדי כדי דלדול-DA. הגפיים הנגדי לא מוצג רק ליקויים ביציבה ובתנועה, הם השתתפו פחות ליזום ולשמר הנעה מאשר בגפיים ipsilateral. ממצאים אלה לא רק לחשוף את גירעונות חדשים משנית חד צדדית DA-דלדול, אלא גם להראות כי rotorod יכול לספק כלי חזק לניתוח איכותי של התנועה.

Protocol

Rotorod מנגנון הליכה

Rotorod היה גליל מסתובב, 4 ס"מ קוטר, קבועים 35 ס"מ מעל הקרקע, מוקף פרספקס שקוף. גליל rotorod היה מכוסה ציפוי גומי מחוספס, המאפשר המתיחה. הרצפה של המנגנון היתה מכוסה בשכבה של קצף על מנת למנוע פציעות כאשר חיות נפל. מנוע חשמלי קטן בתנאי כוח להפוך את rotorod באמצעות חגורת גומי. Rotorod הוקמה כדי לסובב פעם ב 5 s.

וידאו הקלטות קינמטיקה

מצלמה במהירות גבוהה וידאו דיגיטלי שימש הסרט בעלי חיים, באמצעות מהירות תריס של 1000 של שנייה. החזית, לרוחב, ותצוגות האחורי צולמו בעוד החיה הלך על rotorod. שני זרוע ניקון, MII מקור אור קר סט אחד של אורות של סיבים אופטיים שימשו כדי לספק תאורה נאותה במהלך ההקלטה. קלטות נותחו מסגרת לפי מסגרת באמצעות Sony DSR 20 הסיפון DV CAM. מסגרות וידאו נלכדו באמצעות grabber מסגרת מחשב מקינטוש.

הליך בדיקה וניתוח

כדי להעריך את ההבדלים בין תנועות הליכה של 6-OHDA וחולדות שליטה, רשומות וידאו לאחר ניתוח בימים 15-30 (לאחר כל התאוששות מן הנגע יכול להיות צפוי להיות מלא ברובו) נבחנו על ידי שתי עצמאי עיוור לתנאי הניסוי משקיפים. הנגע nigrostriatal 6-OHDA הושרה באונה הימנית, וכתוצאה מכך ליקויי בר קיימא הקדמי ועל שמאל הגפיים האחוריות. סולם הדירוג פותחה כדי שיעור היציבה של חולדות תנועות דריכה של forelimbs (Whishaw et al., 2003). חמשת המרכיבים של דריכה דורגו:

1. יציבה, דירוג של היציבה נעשה על ידי בחינת המיקום של החולדה על התוף;
2. להרים ולשחרר, את החלק של מחזור המדרך שבה כפה הוסר מן התוף;
3. לשאת, את החלק של מחזור דורך בו איבר נערך מעל התוף כמו החולדה התקדם;
4. מראש, החלק של להגיע שבה איבר הוארך להשיב במגע עם התוף; ו
5. מיקום, שבו כפה הוצב חזרה על התוף.

הקריטריונים הבאים שימשו כדי להגדיר תנועה נורמלית:

• יציבה: גוף החולדה היה מונחה על התוף עם ראש הרים.
• הרם ולשחרר: כתף, מרפק ופרק כף היד הם מכווצת להעלות את הכף מפני השטח של התוף.
• Carry: כפה מוחזק מעל פני השטח של התוף, הספרות הן באופן רופף מכווצת, ואת ספרה טיפים מרוכזים על קו האמצע של הגוף. מראש: איבר מוארך קדימה עם הספרות נע מעמדה לעמדה semiflexed מורחבת ופתוחה.
• מיקום: איבר מוארך על הכתף, המרפק, ופרק כף היד לבין ספרות נפתחים למקום כפתו קדימה על פני השטח של התוף, עם 2 ספרות (שני ספרה של קו האמצע) ממוקם במרכז כ של חולדה גוף.

כל תנועה דורגה על סולם 3 דרגות: 1 = / התנועה דומה לזה של חולדה שליטה, 0.5 = / התנועה הופיעה חריגה במקצת, 0 = / התנועה הייתה חריגה ברורה (Whishaw et al, 2003).. סולם דירוג זה היה אז בשימוש כדי להעריך חמש תנועות דריכה מן החולדה כל בימים שלאחר הניתוח 1, 3, 5, 7, 9 ו 15. עשרות מתוך חמשת הצעדים היו בממוצע עבור כל חולדה בכל יום, ואת התוצאות נתון ANOVA עם ימים כאמצעי חוזרות ונשנות.

סקירה של rotorod הליכה 6-OHDA ושליטה חולדות

סולם הדירוג התנועה להחיל את מבחן הניתוח הפעלות לניתוח תנועה איכותית. במהלך הפגישות מבחן, הקבוצה 6-OHDA הנגע קיבלו ציונים נמוכים משמעותית מאשר קבוצת הביקורת, F (1,8) = 33.2, p <0.001, אך לא היתה כל השפעה משמעותית של יום מבחן, ולא היתה שם קבוצה משמעותית על ידי האינטראקציה יום מבחן. ציונים של דריכה היו אז ניתחו בנפרד עם forelimb כמשתנה (עבור 6-OHDA החולדות forelimb הנגדי כדי הנגע לעומת forelimb ipsilateral כדי הנגע; עבור החולדות שליטה, כפה שמאל לעומת כף רגל ימין). היתה השפעה משמעותית של Forelimb, F (1,40) = 15.8, p <0.01, והיתה אינטראקציה מובהקת של הקבוצה על ידי Forelimb, F (1,40) = 15.0, p <0.01. מעקב t-בדיקות התברר כי forelimb הנגדי ל-הנגע של הקבוצה 6-OHDA קיבלו ציונים נמוכים משמעותית מאשר forelimb ipsilateral ל-הנגע או forelimbs של חולדות הביקורת, אשר לא היה שונה. על מנת לקבוע אילו רכיבים של התנועה תרמה עשרות עניים מתקבל על ידי קבוצה 6-OHDA, את הצעדים של היציבהרכיבים הפרט של מחזור דריכה מן forelimbs ipsilateral ו הנגדי של הקבוצה 6-OHDA הושוו לערכים שהתקבלו בחולדות הבקרה. הקבוצה 6-OHDA נבדלו יציבה כל הרכיבים דורך על ידי האיבר הנגדי, אבל אף אחד הרכיבים של הגפה ipsilateral (p <0.05).

הבדלים איכותיים תיאורי בתנוחה בשליטה 6-OHDA חולדות

ב חולדה שליטה, הראש מוחזק במצב אופקי, ואת forelimb תמיכה הגפיים האחוריות לפשק את התוף ויוצרים קשת תומכת. 6-OHDA חולדות בדרך כלל הלכו עם הראש למטה עם forelimbs לקוי שלהם (מול הצופה) ממוקם קרוב יותר יחד גבוה יותר על פני השטח תוף מאשר התרחש על הגפיים ipsilateral או הגפיים של חולדות הביקורת (ראו וידאו חולדה שליטה עם ציון "1" עבור יציבה, ואת חיה 6-OHDA הנגע עם ציון של "0"). בדרך כלל, חריגות בתנוחה ניתן לראות במבט אחד מן המיקום היחסי של ראש של חולדה.

Forelimb דריכה

בתוך רצף הבקרה, forelimb המדרך הוא הרים את ידי הגמשת, כתף מרפק ופרק כף היד. כמו איבר מורם, הספרות הן באופן רופף מכווצת, ואת איבר הוא הרים היטב מעל פני השטח של התוף. כאשר איבר היא מתקדמת, היא המורחבת על הכתפיים, מרפק היד וגם היא ממוקמת הספרות מורחבות ופתוח. בהשוואה לחולדות הבקרה, את המשרעת של כל הרכיבים של החולדות DA-מדולדל הנגדי כדי איבר הנגע הוא נחלש. איבר משחרר את התוף לאחר מכן, הוא הרים פחות, היא מתקדמת מרחק קצר יותר מאשר הוא forelimb שליטה. בנוסף, כאשר הוא הרים את האיבר, הספרות הן מתוחות יותר, כאשר האיבר ממוקם, הספרות מורחבות ופתח פחות מאלה של חולדה שליטה. Forelimb שליטה הרים פעם שהוא מגיע החלק העליון של התוף, פרק כף היד הוא כופף להרים את הכף למעלה וקדימה, ואת היד מושטת כמו ההתקדמות איבר. לעומת זאת, חולדה 6-OHDA של הנגדי כדי forelimb הנגע מתבצעת נוסף caudally על ידי התנועה של התוף, ובכך משחרר מאוחר יותר עם היד המורחבת עדיין. כיפוף של פרק כף היד נראה פסיבי מתרחשת הספרות מתבצעות לאחור על ידי התנועה של התוף, וכאשר forelimb מובא קדימה, כפה והזרוע לא הרים בבירור את פני התוף. Forelimb של חולדה לשלוט מרחיב גם קדימה הספרות לפתוח את ההתקדמות איבר. כמו איבר ממוקם, היא ממוקמת עם התנועה arpeggio, עם 5 ספרות לפנות את פני השטח של התוף הראשון, ואחריו ברציפות על ידי 4 ספרות, 3 ו 2. לעומת זאת, ענף של עכברוש 6-OHDA הוא הרים והאריך פחות, הספרות מורחבות פחות, והם לפנות את פני השטח של התוף כמעט בד בבד עם "סטירה". בסרט רואים את תנועות דריכה forelimb ב חיה בקרה דורגו "1", תנועות דריכה forelimb בעלי חיים 6-OHDA הנגע כי דורגו בעיקר בתור "0".

איבר הינד דריכה

היו גם ליקויים ב הנגדי ל-הנגע הגפיים האחוריות של חולדות 6-OHDA. כמו איבר לשלוט האחוריות נע לאחור, נראה לדחוף כנגד התוף מסתובב כפי שהיא עושה כל כך, האצבעות לסובב החוצה. כמו איבר נע קדימה, הוא הניף את הרגל החוצה. איבר האחוריות של חולדות 6-OHDA עובר ישירות לאחור עם סיבוב התוף אם בכלל, פונה מעט פנימה. כמו איבר נע קדימה, כף הרגל מתבצעת ישירות קדימה. כף הרגל של החולדה מצבי שליטה כלפי חוץ כפי שהוא מתקדם, האצבעות מוחזקות גבוה יותר מאשר הקרסול, ואת אצבעות להרחיב. במהלך המיקום של החולדה שליטה, בוהן 5 קשרים פני השטח של התוף משקל הראשון מופץ ברחבי אצבעות כף היד. לעומת זאת, אצבעות של חולדה 6-OHDA הם מכווצת במהלך לשאת והשמה נעשית ללא תנועה arpeggio. האצבעות של עכברוש הבקרה משתחררים בתבנית arpeggio הפוך כמו הבוהן 5 יוסר הראשון הבוהן 1 הוא הרים האחרון. תנועה זו היה חסר חולדה 6-OHDA את הנגע תוך הקרסול שלה שמרה מכווצת יציבה במהלך התנועה נושאים. שוב תנועות מראש של עכברוש 6-OHDA הם נחלש, עם האיבר exorotated פחות, הרים פחות, מתקדמים פחות מזו של עכברוש הבקרה. כמו חולדות בקרה מקום הבהונות שלהם, הם המורחבת ופתח, כך הבוהן 5 נקודות ביחס רוחבית לגוף החולדה. טו 5 קשרים התוף בעקבות לראשונה על ידי האצבעות הנותרות כך החולדה נתמך משקלו על קצות הבוהן. עבור חולדה 6-OHDA, את הבהונות הן קצת מכווצת כמו את כף הרגל מתבצעת קדימה, האצבעות נמוכים לקרוב אופקי הקרסול, יש פחות הפתיחה של האצבעות כאשר כף הרגל מונחת על התוף. אורך סטרייד גם מעט קצר יותר מזה של חולדות שליטה. על מנת לכמת את ההבדלים בין המשךרול ו - 6-OHDA תנועות הגפיים האחוריות, מרכיבי להרים שחרור, לסחוב, קידום, ומיקום דורגו על סולם 3 נקודות, כמו גם forelimbs. הצעדים נעשו מרשומות וידאו עשה ביום הניתוח שלאחר 20, ושלושה מחזורים צעד דורגו עבור כל חולדה. היו הבדלים משמעותיים Group F (1,8) = 47.6, p <0.001. מעקב t-בדיקות על רכיבים ציינו כי כל הרכיבים של החולדות לשלוט קיבלו ציונים גבוהים יותר משמעותית מאשר הרכיבים של החולדות 6-OHDA. בסרט רואים את תנועות הגפיים האחוריות צועדת חיה בקרה דורגו "1". איבר הינד דריכה תנועות של 6-OHDA המוצג בסרטון דורגו בעיקר עם ציון של "0".

Discussion

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לבדוק האם בדיקת rotorod עבור מיומנות תנועה מכרסם יכול לשמש לבדיקה איכותית של היציבה, דריכה forelimb ואת איבר האחוריות דריכה בחולדות מערכת העצבים נפצעו. לניתוח, חולדות עם החד צדדית depletions התובע וחולדות הביקורת וידאו שהוקלט מתצוגות הקדמי, לרוחב האחוריים. סולם דירוג של היציבה ותנועות forelimb ציינו כי תנועות דריכה היו לקויי כרוני לאחר הניתוח. בדיקה של תנועות הגפיים ציינו כי בעוד DA-מדולדל חולדות יכול להשתמש בגפיים הנגדי כדי הנגע לתמיכה, הם קיבלו שימוש מינימלי עבור העברת משקל. התוצאות של מחקר זה עולה כי המשימה rotorod, בנוסף לספק מדדים כמותיים של המנוע ליקויי, יכול גם לספק תובנות ליקויי איכותי.

המשימה rotorod כבר בשימוש נרחב להערכת מצב המנוע של מכרסמים. נכון להיום המדד העיקרי שנלקח המשימה הם נקודת הסיום אמצעים, אמצעים של מהירות / משך חיים כי הוא מסוגל ללכת. הרגשנו כי יש תכונות של המשימה שעשוי להפוך אותו אידיאלי עבור הבדיקה האיכותית של תנועות ההליכה. ראשית, משום חיה לאזן צעד, המשימה כרוך מיומנות רבה ועלולה ובכך לחשוף ליקויים שלא ניתן לכאורה משימות פשוטות של תנועה overground (Schallert et al, 1992;. אולסון et al, 1995;. Chang et al. , 1999; מיור Whishaw1999b; מץ et al, 2005).. הרגישות של משימה זו שיטת ניתוח וידאו מודגם על ידי נוכחות של ליקויי בשלבים אקוטי וכרוני לאחר הפגיעה. שנית, בעלי חיים לא צריך להיות מקופח מזון או מים כדי להניע התנהגות, כנדרש לחקר forelimb מיומן לכת (Miklyaeva et al. 1994). שלישית, המשימה דורשת הכשרה מינימלית. לדוגמה, הצלחנו לצלם תנועות דריכה בהקדם החיה הוצב המנגנון. רביעית, משום שהחיה נותרת במקום תוך דריכה, קל יותר תנועות להקליט וידאו מתוך מגוון של זוויות. חמישית, שיטה המאפשרת ניתוח והערכה של היבטי איכותי של תנועות הליכה עם מערכת דירוג פשוטה. מערכות דירוג להפיק תוצאות אמינות אפילו רצף אחד מתוך הקלטה חיה, ולכן הם זמן יעיל הנסיין.

על ידי פיתוח בקנה מידה פשוטה 3 נקודות דירוג יציבה, ובמשך ארבעה מרכיבים של מחזור דריכה (להרים, לסחוב, מראש, במקום) היה אפשר לזהות ליקויי את הנגדי ל-הנגע הגפיים של החולדות DA-מדולדל מוקדם ככל יום אחד לאחר הניתוח. ליקוי נראה כי ליקוי כרוני היה דומה ב 15 ימים לאחר הניתוח, וכן בדיקות פורמליות נתון מספר חודשים לאחר הניתוח. למרות הצעדים שלנו נגזרו רבים ככל חמישה מחזורים דריכה לכל חולדה, ליקוי היה חזק מספיק כדי להיות מזוהה ממעגל דריכה אחת גם את forelimbs או הגפיים האחוריות. ירידת השימוש של הגפיים היה גם ברור בתנוחה של בעלי חיים, כך בדיקה פשוטה של ​​היציבה של בעל החיים יכול לגלות שיש לו פגיעה.

מספר מחקרים קודמים זיהו את מקור הפגיעה בגפיים של 6-OHDA חיות הנגע (Miklyaeva et al, 1995;. מוריסי et al, 1989;. מיור Whishaw, 1999a;. Schallert et al, 1979). הגפיים לקויי מסוגלים לתמוך במשקל הגוף ואת הרפלקסים ברית הנדרש כדי לשמור על יציבה נוכחים. לפיכך בעלי חיים מסוגלים לעמוד על הגפיים, והם סד מפני ניסיונות לתפוס אותם. הגפיים משמשות כדי להחזיר תמיכה יציבה, כאשר התמיכה היא איבדה. כך חיות יהיה צעד או הופ להשיב תמיכה כאשר הם מאבדים שיווי המשקל שלהם. במהלך הליכה או מפנה, הגפיים להשתתף דורך, אבל רק כאשר את המומנטום של החיה מחליף את הענף תפקידה לתמוך ביציבה. לפיכך, בעת תנועה overground החיה הנגע חד צדדית "צולע" כמו גפיים לקוי שלה להדביק את קדימה בתור מחליף של החיה תנועת איבר מתמיכה יציבה. כאשר מפנה, את צירי חיה על איבר האחוריות לקוי שלה כאשר מפנה ipsilateral אל האיבר לקוי, והוא "נופל" כאשר פונים אל האיבר הנגדי האחוריות לקויי כדי לתפוס אותו בפעולה התומכים שלו. הצלחנו לצפות ליקויי דומה מאוד, לתמוך במשקל אך לא משקל הסטה, את הנגדי ל-הנגע הגפיים של החולדות שקיבלו חד צדדית 6-OHDA נגעים כשצעדו על התוף. אמנם הן איבר forelimb ו האחוריות שימשו תמיכה יציבה, איבר לא הופיע לשמש משקל משתנה. לדוגמה, הן forelimb ואת איבר האחוריות הוסרו מן התוף הרבה יותר מאוחר ממה שהתרחש על איבר נפגע, או הגפיים של חולדות שליטה. כאשר תנועת תוף העקורים איברים של פונקציות תמיכה שלהם, תנועת קדימה שלהם נחלש, נע רק את המרחק הנדרש כדי לתמוך במשקל הגוף. גם אניforelimb mpaired ולא איבר האחוריות נראה להרים את הגוף מספיק כדי להזדווג זוג שלה יכול להניף ברור על פני התוף. גפיים גם לא נראה להשתתף העברת משקל החולדות קדימה. לדוגמה, בעוד הגפה האחוריות של חולדות בקרה החטוף ודחף נגד התוף כדי להניע קדימה את החיה, החולדות עשה תנועות עם הגפיים האחוריות דומה לקוי שלהם.

היינו גם יכולים לראות כמה תכונות חדשות של תנועות עכברוש דריכה ובכך ליקויי רומן בדרך שבה DA-מדולדל חולדות עבר איבר לקוי שלהם. הן forelimb ואת איבר האחוריות קשר עם תוף עם משטח התנועה arpeggio שבו ספרה בחוץ (5 ספרות) יצר קשר עם משטח התוף הראשון, ואחריו ברציפות של 4 ספרות, 3 ו 2. Forelimb לקויי איבר האחוריות לא נראה דומה לאתר לצפות את משטח התוף, וכך יצר קשר עם השטח עם תנועת כף היד כלפי מטה להחמיא. תנועה דומה arpeggio תוארה בכפו של חולדות כפי שהם מקום בכפו שלהם לתפוס מזון (Whishaw ו גורני, 1994), תנועה זו נפגעת גם באיבר לקוי של DA-מדולדל חולדות (Miklyaeva et al. 1994 ). לסיכום, תוצאות המחקר הנוכחי מצביעות על כך כי rotorod יכול לספק דרך יעילה מאוד לבחון יציבה לדרוך בחולדות נפגע המוח. המשימה דורשת איזון תנועות דריכה מיומן, דורשת הכשרה מינימלית, לא גמול מזון מניע, והוא קל להבקיע וקולנוע. בנוסף, נצפתה על ליקויי rotorod ניתן להכליל למצבים מבחן אחרים.