El uso de Rotorod como un método para el análisis cualitativo de la Ruta de la rata

Summary

La prueba rotorod se utiliza para evaluar el estado del motor en el movimiento de caminar de la hemi-Parkinson ratas analógica.

Abstract

La prueba rotorod, en el que los animales caminen sobre un tambor giratorio, es ampliamente utilizado para evaluar el estado del motor en los roedores de laboratorio. El rendimiento se mide por el tiempo que un animal se mantiene hasta en el tambor en función de la velocidad del tambor. Aquí mostramos que la tarea es una fuente rica de información sobre los aspectos cualitativos de los movimientos de caminar. Debido a que los movimientos se realizan en una ubicación fija, que fácilmente se puede examinar utilizando métodos de alta velocidad de grabación de vídeo. El presente estudio se realizó para examinar el potencial de la rotorod para revelar los cambios cualitativos en los movimientos a pie de hemi-Parkinson ratas analógica, producida por la inyección de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) en el paquete nigroestriatal derecho a agotar la dopamina nigroestriatal (DA ). A partir del día siguiente de la cirugía y luego periódicamente durante los próximos dos meses, las ratas fueron filmadas desde puntos de vista frontal, lateral y posterior, mientras caminaban en el rotorod. Comportamiento fue analizado por reproducir fotograma a fotograma de las grabaciones de vídeo. Las escalas de calificación de dar un paso comportamiento indica que las ratas hemi-Parkinson fueron dañados de forma crónica en su postura y en el uso de las extremidades contralateral a la DA-agotamiento. Las extremidades contralateral no sólo se muestra anomalías posturales y de movimiento, que participó menos en el inicio y el mantenimiento de propulsión que hizo las extremidades ipsilateral. Estos resultados no sólo revelan nuevos déficits unilateral secundaria a DA-agotamiento, pero también muestran que el rotorod puede proporcionar una sólida herramienta para el análisis cualitativo del movimiento.

Protocol

Rotorod aparato de caminar

El rotorod era un cilindro giratorio, 4 cm de diámetro, fija 35 cm sobre el suelo y rodeado de plexiglás transparente. El cilindro rotorod estaba cubierta de revestimiento de goma de textura, lo que facilita la tracción. El suelo del aparato estaba cubierto con una capa de espuma para evitar lesiones cuando los animales se redujo. Un pequeño motor eléctrico siempre encendido para encender el rotorod a través de una correa de goma. El rotorod se estableció para girar una vez cada 5 s.

Las grabaciones de vídeo y la cinemática

Una cámara de video de alta velocidad digital se utilizó para filmar a los animales, con una velocidad de obturación de un 1000 de segundo. La parte frontal, lateral y trasera puntos de vista fueron filmadas mientras el animal caminaba en la rotorod. Una de dos brazos de Nikon, la fuente de luz fría MII y un juego de luces de fibra óptica se utiliza para proporcionar una iluminación adecuada durante la grabación. Las cintas fueron analizadas cuadro por cuadro con una Sony DSR 20 DV CAM cubierta. Los fotogramas de vídeo se capturaron con una tarjeta capturadora y un ordenador Macintosh.

El procedimiento de prueba y análisis

Con el fin de evaluar las diferencias entre los movimientos a pie de la 6-OHDA y el control de ratas, los registros de vídeo de post-quirúrgicas los días 15 - 30 (después de la recuperación de la lesión se podría esperar que en gran medida completa) fueron examinados por dos independientes observadores ciegos a las condiciones experimentales. El nigroestriatal 6-OHDA lesión inducida en el hemisferio derecho, lo que resulta en alteraciones duraderas en primer plano, y dejó las extremidades posteriores. Una escala de calificación se ha desarrollado para votar la postura de las ratas y los movimientos de la intensificación de los miembros anteriores (Whishaw et al., 2003). Los cinco componentes de la intensificación fueron calificados:

1. la postura, la puntuación de la postura se hizo mediante el examen de la posición de la rata en el tambor;
2. levantamiento y la liberación, la parte del ciclo de intensificación en el que se levantó la pata del tambor;
3. realizar, la parte del ciclo de intensificación en el que se llevó a cabo la extremidad por encima del tambor como la rata se adelantó;
4. avance, la parte del alcance en el que se extendió la pierna para recuperar el contacto con el tambor, y
5. colocación, en el que se coloca la pata de nuevo en el tambor.

Los siguientes criterios fueron utilizados para definir un movimiento normal:

• Postura: El cuerpo de la rata se orientó sobre el tambor con la cabeza bien arriba.
• Levantar y soltar: El hombro, el codo y la muñeca en flexión son elevar la pata de la superficie del tambor.
• Llevar: La pata se mantiene por encima de la superficie del tambor, las cifras están ligeramente flexionadas y las puntas de dígitos se centran en la línea media del cuerpo. Avance: La extremidad se extiende hacia adelante con los dedos en movimiento desde una posición semiflexionados a una posición extendida y abierta.
• Colocación: La extremidad se extiende en el hombro, el codo y la muñeca y los dedos se abren para colocar la pata de adelante y en la superficie del tambor, con el dígito 2 (segundo dígito de la línea media), ubicado aproximadamente en el centro de la de la rata cuerpo.

Cada movimiento se mide en una escala de 3 puntos: 1 = / el movimiento parecido al de una rata control, 0,5 = / el movimiento pareció un poco anormal, y 0 = / el movimiento era claramente anormal (Whishaw et al, 2003).. Esta escala de clasificación se utilizó para evaluar cinco movimientos caminar de cada rata en los días de postoperatorio 1, 3, 5, 7, 9 y 15. Las puntuaciones de las cinco medidas se promediaron para cada rata en cada día, y los resultados sometidos a un ANOVA con días como medida repetida.

Resumen de rotorod caminar en 6-OHDA y el control de ratas

La escala de calificación de movimiento se aplica a las sesiones de pruebas post-operatorio para el análisis de movimiento cualitativo. Durante las sesiones de prueba, el grupo de lesiones 6-OHDA recibió puntuaciones significativamente más bajas que el grupo de control, F (1,8) = 33,2, p <0,001, pero no hubo un efecto significativo del día de la prueba, ni tampoco había un grupo importante por la interacción de prueba del día. Las puntuaciones de dar un paso eran entonces analizado por separado con las patas delanteras como una variable (por las ratas 6-OHDA la extremidad anterior contralateral a la lesión en comparación con la extremidad anterior ipsilateral a la lesión, para el control de ratas, la pata izquierda frente a la pata derecha). Hubo un efecto significativo de la extremidad anterior, F (1,40) = 15,8, p <0,01, y hubo una interacción significativa del Grupo por la extremidad anterior, F (1,40) = 15,0, p <0,01. Seguimiento de las pruebas t indicaron que la extremidad anterior contralateral a la lesión del grupo 6-OHDA recibió puntuaciones significativamente más bajas que la extremidad anterior ipsilateral a la lesión o las patas delanteras de las ratas de control, que no fue diferente. Con el fin de determinar qué componentes del movimiento contribuyó a los resultados pobres obtenidos por el grupo 6-OHDA, las medidas de la posturay los componentes individuales del ciclo de la intensificación de las extremidades anteriores ipsilateral y contralateral del grupo 6-OHDA se compararon con los valores obtenidos de las ratas control. El grupo 6-OHDA difieren en la postura y todos los componentes de refuerzo hecha por la extremidad contralateral, pero ninguno de los componentes de la extremidad ipsilateral (p <0,05).

Diferencias cualitativas y descriptivas de la postura en el control y las ratas 6-OHDA

En un control de ratas, la cabeza se mantiene en posición horizontal, y la extremidad anterior de apoyo y las extremidades posteriores se sitúan en el tambor de la formación de un arco de soporte. Las ratas 6-OHDA suelen caminar con la cabeza hacia abajo con sus patas delanteras con discapacidad (de cara al espectador) coloca más cerca y más arriba en la superficie del tambor que se produjo a las extremidades ipsilateral o de los miembros de las ratas de control (ver video de una rata control puntuación de "1" por la postura, y un animal de 6-OHDA lesión con una puntuación de "0"). Por lo general, la anormalidad en la postura pueden ser vistos a simple vista desde la posición relativa de la cabeza de una rata.

Extremidad anterior pisar

En la secuencia de control, intensificando la extremidad anterior se levanta por la flexión del hombro, codo y muñeca. A medida que la extremidad se levanta, las cifras están ligeramente flexionadas, y el miembro se eleva muy por encima de la superficie del tambor. Cuando el miembro se avanza, se extiende a los hombros, codos y muñecas y que se coloca los dedos están extendidos y abiertos. En comparación con las ratas control, la amplitud de todos los componentes de las ratas DA-agotado en la extremidad contralateral lesión se atenúa. El miembro libera el tambor más tarde, se levanta menos, y se avanza una distancia más corta de lo que la extremidad anterior de control. Además, cuando el miembro está levantado, los dedos se flexionan más, y cuando la extremidad se coloca, los dígitos se extendió y abrió inferiores a los de una rata control. La extremidad anterior de control se levanta una vez que alcanza la parte superior del tambor, la muñeca se flexiona para levantar la pata hacia arriba y adelante, y se extiende la muñeca a medida que avanza la extremidad. Por el contrario, las ratas 6-OHDA es contralateral a la lesión de extremidad anterior se lleva más caudal por el movimiento del tambor, y por lo tanto versiones posteriores con la muñeca aún extendida. La flexión de la muñeca que parece ser pasivo y se produce como los dígitos se llevan hacia atrás por el movimiento del tambor, y cuando la extremidad anterior se adelanta, la garra y el antebrazo no se levantó claramente fuera de la superficie del tambor. La extremidad anterior de una rata control se extiende también hacia adelante y los dedos abiertos a medida que avanza la extremidad. A medida que la extremidad se coloca, se coloca con un movimiento de arpegio, con el dígito 5 en contacto con la superficie de la primera batería, seguido sucesivamente por los dígitos 4, 3, y 2. Por el contrario, el miembro de la rata 6-OHDA se levanta y se extendió menos, las cifras son menos extensas, y en contacto con la superficie del tambor casi al mismo tiempo una "bofetada". El video muestra los movimientos de extremidad anterior en una intensificación del control de animales que fueron calificados como "1", y la extremidad anterior movimientos de caminar en un animal de lesión 6-OHDA que se anotó principalmente como "0".

Las extremidades posteriores caminar

También hubo deficiencias en las extremidades traseras contralateral a la lesión de las ratas 6-OHDA. A medida que el control de las extremidades traseras se mueve hacia atrás, parece empujar contra el giro del tambor y al hacerlo, los dedos del pie gira hacia afuera. A medida que la extremidad se mueve hacia delante, el pie se gira hacia el exterior. La extremidad posterior de la rata 6-OHDA se mueve directamente hacia atrás con la rotación del tambor, y en todo caso, gira ligeramente hacia el interior. A medida que la extremidad se mueve hacia delante, el pie se lleva directamente hacia adelante. El pie de los cambios de control de las ratas hacia el exterior y que se avanza, los dedos se mantienen más altos que el tobillo y los dedos del pie se extienden. Durante la colocación de cinco ratas control, dedo del pie en contacto con la superficie de la primera batería y el peso se distribuye a través de los dedos y la palma. Por el contrario, los dedos de la rata 6-OHDA se doblan durante transporte y la colocación se realiza sin un movimiento de arpegio. Los dedos de los pies de la rata de control son liberados en un patrón de arpegio invertido en los pies 5 se levanta primero y un dedo del pie se levanta pasado. Este movimiento había desaparecido en la rata lesión 6-OHDA, mientras que el tobillo ha mantenido su postura en flexión durante el movimiento de llevar. Una vez más los movimientos de avance de las ratas 6-OHDA se atenúan, con la extremidad inferior exorotated, levantó menos, y menos avanzado que el de la rata control. Como el control de ratas colocar sus dedos de los pies, se extienden y se abrió, de manera que los pies 5 puntos lateralmente con respecto al cuerpo de la rata. Toe 5 contacto con el tambor primero, seguido por los dedos restantes de tal manera que la rata apoya su peso sobre las puntas de los pies. Para la rata 6-OHDA, los dedos del pie son algo flexionadas cuando el pie se lleva adelante, los dedos del pie son más bajos en relación a la horizontal en el tobillo, hay menos apertura de los dedos del pie cuando el pie se coloca en el tambor. Longitud de la zancada es también algo más corto que el de las ratas control. Con el fin de cuantificar las diferencias entre control y la 6-OHDA movimientos de las extremidades traseras, los componentes de la elevación y la liberación, llevan, el progreso y la colocación fueron valorados en una escala de 3 puntos, al igual que las patas delanteras. Las medidas se realizaron de los registros de video hecho en el día postoperatorio 20, y tres ciclos de paso se clasificaron para cada rata. No hubo diferencias significativas entre los grupos, F (1,8) = 47,6, p <0,001. Seguimiento de las pruebas t de los componentes indicó que todos los componentes de las ratas control recibieron una puntuación significativamente mayor que con los componentes de las ratas 6-OHDA. El video muestra los movimientos de las extremidades traseras pisar un control de animales que fueron calificados como "1". Las extremidades posteriores pisando los movimientos en la 6-OHDA se muestra en el video se clasificaron principalmente con una puntuación de "0".

Discussion

El propósito del presente estudio fue examinar si la prueba de habilidad rotorod roedores locomoción se puede utilizar para el examen cualitativo de la postura, dando un paso patas delanteras y la extremidad posterior intensificación de las ratas del sistema nervioso lesionado. Para el análisis, las ratas con disminuciones unilaterales DA y el control de ratas fueron de vídeo grabados desde puntos de vista frontal, lateral y posterior. Una escala de valoración de la postura y los movimientos de extremidades anteriores indicaron que los movimientos de caminar fueron dañados crónica después de la cirugía. Examen de los movimientos de los miembros indicó que mientras que las ratas DA-empobrecido podía utilizar las extremidades contralateral a la lesión de apoyo, que recibió un uso mínimo de cambio de peso. Los resultados de este estudio indican que la tarea rotorod, además de proporcionar medidas cuantitativas de la deficiencia motora, también puede proporcionar información sobre la alteración cualitativa.

La tarea rotorod ha sido ampliamente utilizada para evaluar el estado del motor de los roedores. Hasta la fecha, la principal medida tomada de la tarea son las medidas de punto final, las medidas de la velocidad / duración que un animal es capaz de caminar. Sentimos que hay atributos de la tarea que podría hacer que lo hace ideal para el examen cualitativo de los movimientos de caminar. En primer lugar, porque un animal debe equilibrar y paso, la tarea implica habilidad y por lo tanto puede revelar alteraciones que pueden no ser evidentes en las tareas más simples de la locomoción de superficie (Schallert et al, 1992;. Olsson et al, 1995;. Chang et al. , 1999; Muir y Whishaw1999b; Metz et al, 2005).. La sensibilidad de esta tarea y el método de análisis de vídeo se demuestra por la presencia de alteraciones en las fases aguda y crónica después de la lesión. En segundo lugar, los animales no tienen que ser privados de alimentos o agua para motivar la conducta, como se requiere para el estudio de la extremidad anterior cualificados alcance (Miklyaeva et al., 1994). En tercer lugar, la tarea requiere una formación mínima. Por ejemplo, hemos sido capaces de filmar los movimientos de caminar tan pronto como el animal fue colocado en el aparato. En cuarto lugar, porque el animal se mantiene en su lugar mientras paso a paso, es más fácil a los movimientos de grabar vídeo a partir de una variedad de ángulos. En quinto lugar, el método de análisis permite la evaluación de los aspectos cualitativos de los movimientos de caminar con los sistemas de clasificación simple. Los sistemas de clasificación de producir resultados fiables, incluso en una secuencia de grabación de un animal y por lo tanto son tiempo-eficiente para el experimentador.

Mediante el desarrollo de un sencillo de 3 puntos de escala de calificación de la postura, y por cuatro componentes del ciclo del paso a paso (levantar, cargar, avance, y el lugar), fue posible identificar deficiencias en las extremidades contralateral a la lesión de las ratas DA-agotadas tan pronto como un día después de la cirugía. El deterioro parece crónica debido a que el deterioro fue similar a los 15 días después de la cirugía, y en las pruebas informales que dado un número de meses después de la cirugía. A pesar de nuestras medidas se derivan de un máximo de cinco ciclos de caminar por rata, el deterioro era lo suficientemente robusto para ser identificados a partir de un solo ciclo de intensificación en cualquiera de las extremidades anteriores o de las extremidades traseras. El deterioro en el uso de las extremidades también fue evidente en la postura de los animales para que una simple inspección de la postura de que el animal podría revelar que tenía un impedimento.

Una serie de estudios previos han identificado la fuente de la discapacidad en las extremidades de los animales de lesión 6-OHDA (Miklyaeva et al, 1995;. Morrissey et al, 1989;. Muir y Whishaw, 1999;. Schallert et al, 1979). Los miembros dañados son capaces de soportar el peso del cuerpo y los reflejos aliados necesarios para mantener la postura están presentes. Así, los animales son capaces de pararse en las extremidades, y apoyo contra los intentos de desplazar. Las extremidades se utilizan para recuperar el apoyo de la postura, cuando el apoyo se ha perdido. Así, los animales paso o salto para recuperar el apoyo cuando pierden el equilibrio. Al caminar o girar, los miembros participan en la intensificación, pero sólo cuando el impulso del animal desplaza el miembro de su función de apoyo postural. Así, durante la locomoción de superficie del animal lesión unilateral "cojea", como sus miembros con discapacidad de puesta al día como se desplaza el animal es el movimiento hacia delante del miembro de soporte postural. Al girar, los pivotes de los animales en su pata trasera afectada ipsilateral al dar vuelta a la extremidad afectada, y se "cae" cuando se enciende contralateral a la extremidad afectada traseras que lo desplace de su acción de apoyo. Hemos sido capaces de observar deficiencias muy similares, soportar el peso, pero no el cambio de peso, en las extremidades contralateral a la lesión de las ratas que recibieron unilateral 6-OHDA lesiones mientras caminaban en el tambor. Aunque tanto el miembro patas delanteras y traseras se utilizaron para apoyar la postura, ni las extremidades parecían ser utilizado para el cambio de peso. Por ejemplo, tanto las patas delanteras y las extremidades posteriores fueron sacados de la batería mucho más tarde que se produjo en la extremidad intacta, o los miembros de las ratas control. Cuando el movimiento del tambor de los miembros desplazados de sus funciones de apoyo, su avance se vio atenuada, moviendo sólo la distancia necesaria para soportar el peso del cuerpo. Ni la iextremidad anterior mpaired ni la extremidad posterior apareció para levantar el cuerpo lo suficiente para que su compañero de pareja podría inclinar clara de la superficie del tambor. Los miembros tampoco parecen participar en el cambio de peso de las ratas hacia adelante. Por ejemplo, mientras que las extremidades posteriores de control de ratas secuestrado y empujado contra el tambor para impulsar al animal hacia adelante, las ratas se hacen movimientos similares con sus extremidades posteriores con discapacidad.

También pudimos observar algunas características nuevas de los movimientos de la rata paso a paso y por lo tanto deficiencias en la novela la forma en que las ratas DA-agotado trasladado su extremidad afectada. Tanto las patas delanteras y la extremidad posterior contacto con la superficie del tambor con un movimiento de arpegios en la que el fuera de dígitos (dígitos 5) en contacto con la superficie del tambor, en primer lugar, seguido sucesivamente por los dígitos 4, 3, y 2. Deterioro de la extremidad anterior y las extremidades posteriores no parecen localizar de manera similar y anticipar la superficie del tambor, y por lo tanto en contacto con la superficie plana con un movimiento de la palma hacia abajo. Un movimiento similares arpegio se ha descrito en la pata de las ratas, ya que el lugar de sus patas delanteras para agarrar el alimento (Whishaw y Gorny, 1994), y este movimiento se ve afectada también en la extremidad afectada de DA-agotadas las ratas (Miklyaeva et al., 1994 ). En resumen, los resultados del presente estudio indican que el rotorod puede proporcionar una manera muy útil de examinar la postura y la intensificación en el cerebro de ratas lesionadas. La tarea requiere de equilibrio y expertos movimientos paso a paso, requiere una formación mínima, no hay recompensa alimentos motivación, y es fácil de puntuar y el cine. Además, las deficiencias observadas en el rotorod se puede generalizar a situaciones de prueba.