Uso de Rotorod como um método de análise qualitativa de Walking in Rat

Summary

O teste rotorod é usado para avaliar o estado do motor no movimento de caminhar de ratos hemi-Parkinson analógica.

Abstract

O teste rotorod, em que os animais andar sobre um tambor rotativo, é amplamente utilizado para avaliar o estado do motor em roedores de laboratório. O desempenho é medido pela duração que um animal permanece em cima do tambor, em função da velocidade do tambor. Aqui nós relatamos que a tarefa fornece uma rica fonte de informações sobre aspectos qualitativos dos movimentos a pé. Porque os movimentos são realizados em um local fixo, eles podem ser facilmente analisados ​​usando métodos de alta velocidade de gravação de vídeo. O presente estudo foi realizado para examinar o potencial do rotorod para revelar mudanças qualitativas nos movimentos andando de ratos hemi-Parkinson analógico, produzido por injeção de 6 hidroxidopamina (6-OHDA) no feixe direito nigroestriatal de dopamina nigroestriatal a esgotar (DA ). Início no dia seguinte a cirurgia e depois periodicamente ao longo dos próximos dois meses, os ratos foram filmados a partir de vistas frontal, lateral e posterior, enquanto caminhavam no rotorod. Comportamento foi analisado pelo quadro a quadro-repetição dos registros de vídeo. Escalas de avaliação de pisar comportamento indicou que os ratos hemi-Parkinson foram cronicamente prejudicada em sua postura e no uso dos membros contralateral à depleção de DA. Os membros contralateral não apenas disponibilizados alterações posturais e de movimento, que participaram menos de iniciar e manter a propulsão do que os membros ipsilateral. Estes resultados não só revelam déficits nova unilateral secundária à depleção de DA, mas também mostram que a rotorod pode fornecer uma ferramenta robusta para a análise qualitativa do movimento.

Protocol

Rotorod aparelho andando

O rotorod era um cilindro rotativo, 4 cm de diâmetro, 35 centímetros fixo acima do solo e cercado por acrílico transparente. O cilindro rotorod estava coberto de revestimento de borracha texturizada, o que facilita a tração. O piso do aparelho foi coberto com uma camada de espuma, para evitar lesões quando os animais caíram. Um pequeno motor elétrico desde o poder para transformar o rotorod através de uma correia de borracha. O rotorod foi criado para rodar uma vez a cada 5 s.

Gravações de vídeo e cinemática

A alta velocidade da câmera de vídeo digital foi usada para filmar os animais, usando uma velocidade do obturador de um 1000 de um segundo. A frente, lateral, traseira e pontos de vista foram filmados enquanto o animal estava caminhando na rotorod. A dois braços Nikon, MII fonte de luz fria e um conjunto de fibra óptica luzes foram usadas para fornecer iluminação adequada durante a gravação. As fitas foram analisadas quadro a quadro, usando uma Sony DSR 20 DV CAM baralho. Frames de vídeo foram capturados usando uma placa de captura e computador Macintosh.

Procedimento de teste e análise

, A fim de avaliar as diferenças entre os movimentos a pé da 6-OHDA e ratos de controle, os registros de vídeo de pós-cirúrgicas dia 15-30 (após uma recuperação da lesão pode vir a ser em grande parte concluído) foram examinados por dois independentes observadores cegos para as condições experimentais. A lesão 6-OHDA nigroestriatal foi induzida no hemisfério direito, resultando em prejuízos duradouros na frente e deixou-membros posteriores. A escala de classificação foi desenvolvido para taxa de postura dos ratos e os movimentos aprofundamento dos membros anteriores (Whishaw et al., 2003). Cinco componentes de pisar foram classificados:

1. postura, a classificação da postura foi feita através da análise da posição do rato sobre o tambor;
2. elevador e solte, a porção do ciclo em que pisar a pata foi levantada a partir do tambor;
3. transportar, a parte do ciclo de pisar no qual o membro foi mantido acima do tambor como os ratos se movimentavam para a frente;
4. antecedência, a porção do alcance no qual o membro foi estendido para recuperar o contato com o tambor, e
5. colocação, em que a pata foi colocado de volta no tambor.

Os seguintes critérios foram utilizados para definir um movimento normal:

• Postura: O corpo do rato foi orientado sobre o tambor com a cabeça erguida.
• Elevador e release: O ombro, cotovelo e punho são flexionados levantar a pata a partir da superfície do tambor.
• Carry: A pata é mantida acima da superfície do tambor, os dígitos são vagamente flexionados, e as pontas dígitos são centrados na linha média do corpo. Antecedência: O membro é estendido para a frente com os dígitos que se deslocam de uma posição semiflexed para uma posição estendida e aberta.
• Colocação: O membro é estendida no ombro, cotovelo e punho e os dígitos são abertos para colocar a pata para a frente e na superfície do tambor, com 2 dígitos (segundo dígito da linha média), localizado a aproximadamente o centro do de rato corpo.

Cada movimento foi avaliada em uma escala de 3 pontos: 1 = / o movimento parecia o de um rato controle, 0,5 = / o movimento apareceu ligeiramente anormal, e 0 = / o movimento foi claramente anormal (Whishaw et al, 2003).. Esta escala de classificação foi então utilizado para avaliar cinco movimentos pisar de cada rato em dias pós-operatório de 1, 3, 5, 7, 9 e 15. As pontuações das cinco medidas foram calculados para cada rato em cada dia, e os resultados submetidos a uma ANOVA com dias como medida repetida.

Visão geral do rotorod andar em 6-OHDA e ratos controle

A escala de classificação movimento foi aplicado para as sessões de teste pós-operatório para análise do movimento qualitativo. Durante as sessões de teste, o grupo lesão 6-OHDA receberam pontuação significativamente menor do que o grupo controle, F (1,8) = 33,2, p <0,001, mas não houve efeito significativo do dia do teste, nem existia um grupo significativo pela interação dia do teste. As pontuações de pisar foram então analisados ​​separadamente com os membros anteriores como uma variável (para os ratos 6-OHDA no membro anterior contralateral à lesão versus o membro anterior ipsilateral à lesão, para os ratos de controle, a pata esquerda contra a pata direita). Houve um efeito significativo do Membro Anterior, F (1,40) = 15,8, p <0,01, e houve uma interação significativa do Grupo por Membro Anterior, F (1,40) = 15,0, p <0,01. Follow-up t-testes indicaram que o membro anterior contralateral-to-lesão do grupo 6-OHDA receberam pontuação significativamente menor do que o membro anterior ipsilateral-to-lesão ou forelimbs dos ratos de controle, que não diferiram. A fim de determinar quais os componentes do movimento contribuiu para a pontuação pobres obtidos pelo grupo 6-OHDA, as medidas de posturae os componentes individuais do ciclo de pisar do forelimbs ipsilateral e contralateral do grupo 6-OHDA foram comparados aos valores obtidos a partir do controle de ratos. O grupo 6-OHDA diferiam em postura e todos os componentes pisar feita pelo membro contralateral, mas nenhum dos componentes do membro ipsilateral (p <0,05).

Diferenças qualitativas e descritivo de postura no controle e 6-OHDA ratos

Em um rato controle, a cabeça é realizada em uma posição horizontal, e os membros anteriores de apoio e membros posteriores straddle o tambor formando um arco de apoio. Os ratos 6-OHDA normalmente andava com a cabeça para baixo com suas patas dianteiras prejudicada (de frente para o espectador) posicionados mais próximos e mais acima na superfície do tambor do que ocorreu para os membros ipsilateral ou os membros de ratos controle (veja o vídeo de um rato controle com pontuação "1" para a postura, e um animal de lesão 6-OHDA com uma pontuação de "0"). Tipicamente, a anormalidade de postura pode ser visto de relance a partir da posição relativa de uma cabeça de rato.

Forelimb pisar

Na seqüência de controle, o membro anterior pisar é levantada com a flexão do ombro, cotovelo e punho. Como o membro é levantada, os dígitos são vagamente flexionados, eo membro é levantado bem acima da superfície do tambor. Quando o membro é avançado, é estendido na altura dos ombros, cotovelo e punho e como ele é colocado os dígitos são estendidas e abertas. Em comparação aos ratos controle, a amplitude de todos os componentes dos ratos DA-esgotados contralateral à lesão do membro é atenuado. O membro libera o tambor mais tarde, é levantada menos, e é avançado uma distância menor do que o membro anterior de controle. Além disso, quando o membro é levantada, os dígitos são flexionados mais, e quando o membro é colocado, os dígitos são estendidos e abriu menos do que os de um rato controle. O membro anterior de controle é levantada quando ela atinge o topo do tambor, o pulso é flexionado para levantar a pata para cima e para frente, eo pulso é prolongado com o avanço do membro. Por outro lado, o rato 6-OHDA é contralateral à lesão é realizado forelimb mais caudalmente pelo movimento do tambor, e, portanto, versões posteriores com o pulso ainda estendida. Flexão do punho parece ser passiva e ocorre como os dígitos são levados para trás, o movimento do tambor, e quando o membro anterior é trazido para a frente, a pata eo antebraço não estão claramente fora levantada a superfície do tambor. O membro anterior de um rato controle estende bem para a frente e os dígitos aberto com o avanço do membro. Como o membro é colocado, ele é colocado com um movimento arpejo, com 5 dígitos contato com a superfície da primeira bateria, seguido sucessivamente por dígitos 4, 3, e 2. Por outro lado, o membro do rato 6-OHDA é levantada e estendida menos, os dígitos são estendidos menos, e entram em contato com a superfície do tambor quase simultaneamente com um 'tapa'. O vídeo mostra forelimb movimentos pisar em um animal de controle que foram marcados como "1", e forelimb movimentos pisar em um animal de lesão 6-OHDA que foram principalmente classificada como "0".

Membro posterior pisar

Havia também deficiências nos membros contralateral-to-lesão traseiras dos ratos 6-OHDA. Como o membro de controle traseiras se move para trás, parece empurrar a tambor a rodar e como ele faz isso, os dedos do pé girar para fora. Como o membro se move para frente, o pé é oscilado para fora. Do membro posterior do rato 6-OHDA move-se diretamente para trás com rotação do tambor e se alguma coisa, vira um pouco para dentro. Como o membro se move para frente, o pé é feita diretamente para a frente. Ao pé da balança desratização para fora e como ela é avançada, os dedos são mantidos acima do tornozelo, e os dedos dos pés estender. Durante a colocação dos ratos controle, toe 5 contatos a superfície do primeiro tambor eo peso é distribuído entre os dedos dos pés e palma. Em contraste, os dedos dos ratos 6-OHDA são flexionados durante o transporte e colocação é feita sem um movimento de arpejo. Os dedos dos ratos controle são liberados em um padrão de arpejo invertido como toe 5 é levantado primeiro e um dedo do pé é levantado passado. Esse movimento estava faltando no rato lesão 6-OHDA, enquanto o tornozelo mantido a sua postura de flexão durante o movimento de transportar. Mais uma vez os movimentos antes de o rato 6-OHDA são atenuadas, com o membro menos exorotated, levantou menos, e avançou menos do que o do rato controle. Como ratos controle colocar seus dedos, que são estendidas e abertas, tais toe que 5 pontos lateralmente em relação ao corpo do rato. Toe 5 contatos o primeiro tambor seguido pelo restante dos pés de tal forma que o rato suportado seu peso na ponta dos dedos. Para o rato 6-OHDA, os dedos são um pouco como o pé flexionado é levado adiante, os dedos dos pés são mais baixos em relação a horizontal até o tornozelo, há menos abertura dos dedos do pé quando o pé é colocado no tambor. Comprimento da passada também é um pouco menor do que o dos ratos controle. A fim de quantificar as diferenças entre control e 6-OHDA movimentos dos membros posteriores, os componentes de sustentação e liberação, transporte, promoção e colocação foram classificados em uma escala de 3 pontos, assim como os membros anteriores. As medidas foram feitas a partir de registros vídeo feito no dia cirúrgico pós 20, e três ciclos etapa foram classificados para cada rato. Houve diferenças significativas Grupo, F (1,8) = 47,6, p <0,001. Follow-up t-testes dos componentes indicou que todos os componentes do grupo controle receberam pontuação significativamente maior do que os componentes dos ratos 6-OHDA. O vídeo mostra os movimentos dos membros posteriores pisar em um animal de controle que foram marcados como "1". Membro posterior pisar movimentos no 6-OHDA mostrado no vídeo eram principalmente avaliado com uma pontuação de "0".

Discussion

O objetivo do presente estudo foi examinar se o teste para a habilidade rotorod locomoção de roedores pode ser usado para a análise qualitativa da postura, pisando forelimb e dos membros posteriores em ratos pisar sistema nervoso lesionado. Para a análise, ratos com depleção DA unilateral e ratos controle foram de vídeo gravado a partir de vistas frontal, lateral e posterior. A escala de classificação da postura e movimentos forelimb indicou que os movimentos estavam pisando cronicamente prejudicada após a cirurgia. Exame dos movimentos dos membros indicaram que enquanto os ratos DA-esgotados poderia usar os membros contralateral à lesão de apoio, eles receberam um uso mínimo para o deslocamento de peso. Os resultados deste estudo indicam que a tarefa rotorod, além de fornecer medidas quantitativas de motor de deficiências, também pode fornecer insights sobre os prejuízos qualitativos.

A tarefa rotorod tem sido amplamente utilizada para avaliar o estado do motor de roedores. Até à data a principal medida tomada a partir da tarefa são medidas de ponto final, as medidas da velocidade / tempo que um animal é capaz de andar. Sentimos que há atributos da tarefa que pode fazer com que seja ideal para a análise qualitativa dos movimentos a pé. Primeiro, porque um animal deve equilíbrio e passo, a tarefa envolve considerável habilidade e pode, assim, revelar deficiências que podem não ser aparentes nas tarefas mais simples de locomoção overground (Schallert et al, 1992;. Olsson et al, 1995;. Chang et al. , 1999; Muir e Whishaw1999b; Metz et al, 2005).. A sensibilidade desta tarefa eo método de análise de vídeo é demonstrada pela presença de alterações nas fases aguda e crônica após a lesão. Em segundo lugar, os animais não precisam ser privadas de alimentos ou água para motivar o comportamento, conforme exigido para o estudo da forelimb qualificados chegar (Miklyaeva et al., 1994). Terceiro, a tarefa requer um treinamento mínimo. Por exemplo, fomos capazes de filmar movimentos pisar logo que o animal foi colocado no aparelho. Quarto, porque o animal permanece no lugar quando pisar, é mais fácil de movimentos gravar vídeo a partir de uma variedade de ângulos. Quinto, o método de análise permite a avaliação dos aspectos qualitativos dos movimentos caminhando com sistemas de classificação simples. Os sistemas de classificação produzir resultados confiáveis ​​mesmo em uma seqüência de gravação de um animal e, portanto, são tempo-eficiente para o experimentador.

Através do desenvolvimento de uma escala de avaliação simples de 3 pontos de postura, e por quatro componentes do ciclo de pisar (levantar, carregar, antecipadamente, e local), foi possível identificar deficiências nos membros contralateral-to-lesão dos ratos DA-esgotados o mais cedo um dia após a cirurgia. A deficiência crônica surgiu porque o prejuízo foi semelhante aos 15 dias após a cirurgia, e em testes informais dado um número de meses após a cirurgia. Apesar de nossas medidas foram derivadas de até cinco ciclos de pisar por rato, o comprometimento era suficientemente robusto para ser identificado a partir de um único ciclo pisar em qualquer um dos membros anteriores ou membros posteriores. O prejuízo na utilização dos membros foi também evidente na postura dos animais de modo que uma simples inspeção da postura do animal pode revelar que tinha uma deficiência.

Uma série de estudos anteriores identificaram a fonte do comprometimento nos membros de animais 6-OHDA lesão (Miklyaeva et al, 1995;. Morrissey et al, 1989;. Muir e Whishaw, 1999a;. Schallert et al, 1979). Os membros prejudicada são capazes de suportar o peso corporal e os reflexos aliado necessário para manter a postura estão presentes. Assim, os animais são capazes de permanecer nos membros, e eles cinta contra as tentativas de deslocá-los. Os membros são usados ​​para recuperar o apoio postural, quando o suporte está perdido. Assim, os animais vão passo ou salto para recuperar o apoio quando eles perdem o equilíbrio. Durante a caminhada ou virar, os membros participar de pisar, mas só quando o impulso do animal desloca o membro do seu papel no apoio postural. Assim, durante a locomoção do animal overground lesão unilateral "manca", como seus membros prejudicada catch-up como desloca o animal movimento para frente do membro de suporte postural. Ao ligar, os pivôs animal à sua parte prejudicada traseiras quando virar ipsilateral ao membro prejudicada, e ela 'cai' na virada para o membro contralateral prejudicada traseiras para deslocar-a da sua acção de apoio. Pudemos observar deficiências muito semelhantes, mas não suportar o peso de peso mudando, nos membros contralateral-to-lesão dos ratos que receberam unilateral 6-OHDA lesões enquanto caminhavam no tambor. Embora ambos os membros do membro anterior e posteriores foram utilizados para suporte postural, nem membro parecia ser usado para deslocar o peso. Por exemplo, tanto o membro anterior e dos membros posteriores foram levantadas a partir do tambor muito mais tarde do que ocorreu para o membro intacto, ou a membros de ratos controle. Quando o movimento do tambor deslocadas os membros de suas funções de apoio, o seu movimento para a frente foi atenuada, movendo-se apenas a distância necessária para suportar o peso corporal. Nem os iforelimb mpaired nem o membro posterior apareceu para levantar o corpo o suficiente para que seu companheiro par poderia balançar clara da superfície do tambor. Os membros também não parecem participar na mudança do peso dos ratos para a frente. Por exemplo, enquanto o membro posterior de ratos controle sequestrado e empurrado contra o tambor para impulsionar o animal para a frente, os ratos faziam movimentos similares com seu membro prejudicada traseiras.

Pudemos também observar algumas características inovadoras dos movimentos do rato e assim pisar deficiências romance na maneira em que os ratos com depleção DA mudou seu membro prejudicada. Ambos forelimb eo membro posterior contato com a superfície do tambor com um movimento arpeggio em que o dígito de fora (5 dígitos) contatou a superfície do tambor primeiro lugar, seguido, sucessivamente, por algarismos 4, 3, e 2. O forelimb prejudicada e dos membros posteriores não pareceu semelhante localizar e antecipar a superfície do tambor, e assim contactado a superfície com um alisador movimento palma para baixo. Um movimento arpejo semelhante foi descrito na pata de ratos como eles colocam as patas dianteiras para agarrar alimentos (Whishaw e Gorny, 1994), e esse movimento também é prejudicada no membro prejudicado do DA-esgotados ratos (Miklyaeva et al., 1994 ). Em resumo, os resultados do estudo indicam que que o rotorod pode fornecer uma forma muito útil de examinar a postura e pisar no cérebro de ratos feridos. A tarefa exige equilíbrio e hábeis movimentos pisar, requer treinamento mínimo, não há recompensa alimentar motivador, e é fácil de pontuação e cinema. Além disso, deficiências observadas na rotorod podem ser generalizados para situações de teste outro.