Summary
כאן אנו מתארים כיצד לקשור זבוב מנגנון לקשור מגנטי (OMT) חוש הריח. אנו מתארים כיצד ליישר את הארץ נדיר מגנטים יציאות ריח, וכיצד להגדיר זרימה שיעורי מסה למסירה הן הגירוי יניקה ואקום להשיג מעקב ריח אופטימלית.
Abstract
זה כבר ברור במשך שנים רבות כי חרקים להשתמש רמזים חזותיים לייצב הכותרת שלהם בזרם הרוח. בעלי חיים רבים לעקוב ריחות נישא ברוח. ככזה, ייצוב נגד הרוח מעקב ויזואלי של עזרי ישירות מעקב ריח. אבל לעשות אותות הריח ישירות להשפיע על התנהגות מעקב חזותי באופן עצמאי רמזים הרוח? כמו כן, מבול לאחרונה מחקר על נוירופיזיולוגיה וגנטיקה של neurobehavioral olfaction ב תסיסנית יש מוטיבציה מבחני התנהגות יותר ויותר מתוחכמים מבחינה טכנית והן מבחינה כמותית. הנה, אנחנו שונה מערכת לקשור מגנטי המציאו במקור על ידי לאבזר את הזירה עם צרות הזרימה למינרית נוצות ריח לניסויים חזון. זבוב מודבק סיכה פלדה קטנים המרחפים שדה מגנטי המאפשר לו לסבסב בחופשיות. מזון קטנים בקוטר נוצות ריח מופנים כלפי מטה על ראשו של זבוב, לעורר מעקב יציבה על ידי זבוב רעב. כאן נתמקד המכניקה קריטית של קשירה, יישור מגנטים, להמציא את הפלומה ריח, ואת אישור מעקב ריח יציב.
Protocol
הקדמה
OMT הוא עיבוד של מערכת לקשור מגנטי [1] שנועד לשלב "סימולטור פלומת וירטואלי". הפרוטוקולים הבא יסביר כיצד שצריך לקשור זבובים (חלק 1) ולספק אסטרטגיות הגדרת מגנטים (חלק 2) ו המוני תזרים ריח מוסדר אספקת המערכת (Part3). המידע המתואר כאן הוא אופטימיזציה עבור מערכת זו בפרט עשוי להשתנות עבור רכיבים עם מפרטים טכניים אחרים.
חלק 1: זבובים קשירה
השלבים המתוארים כאן קשירה דומים במחקרים קודמים רבים [2], אך מותאם לשימוש OMT [3]. קשירה נכונה היא קריטית כדי להבטיח ניסויים ניסיוני חזקים הדיר. חשיבותה של קשירה זהיר לא יכול להיות מוגזמים.
- איסוף זבובים 4-6 ימים eclosion הודעה ולהרעיב אותם במשך 4-6 שעות. המקום kimwipe טבולה במים הבקבוקון ולהישאר ללא מזון כדי למנוע התייבשות.
- העברת קבוצה של זבובים מבקבוק כדי בקבוקון קטן, להכניס אותו לתוך גוש נחושת על הבמה קירור Peltier נקבע על כ -4 מעלות צלזיוס. הטמפרטורה הנכונה מרדים הזבובים בתוך כ 30 שניות.
- מיין הזבובים על פני השטח קרים שלב הקירור. Kimwipe לח מבטיחה קירור מתמיד הפתילה לחות לציפורן. בחר את הנקבות הגדולות עבור קשירה.
- בעזרת מברשת בסדר, לדחוף זבוב אחד למצב בתוך סרקופג שהותקן מעוצב כדי להתאים את סוג אחד בר נשים זבוב הפירות.
באיור 1.
אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות. - אנחנו בעמדה סיכה minutien (קנסות כלי מדעי) עם מוט מגנטי רכוב על micromanipulator. סיכה היא להיות מיושר כזה בסוף בוטה נוגע החזה הגבי רק מאחורי הראש בין שני האגפים. פין צריכה להיות אנכי לחלוטין כאשר הם מוצגים חזיתית לכיוון העיניים. אפילו כמות קטנה של 'רול "לטוס בין לבין פין לא יכול להיות נסבל. הזווית הצדדית בין הפינים לבין ציר זמן של הגוף צריך להיות בזווית האף למעלה של 30 מעלות ביחס לאופק (איור 1). הערה: פעולה אופטימלית לקשור את המגנט, סיכות ייתכן שיהיה צורך גזוז מאמצים קצרים. זה יהיה תלוי אך ורק על המרחק בין מגנטים ההשעיה.
- לאחר סיכה minutien מיושר, השתמש תיל פלדה דקים לחול ירידה קטנה של UV-מופעל דבק (ElectroLite קורפ) בסוף בוטה של הסיכה minutien.
- לתפעל את הסיכה, כך טיפה דבק מגע החזה של הזבוב בדיוק מעל הראש. עם גודל טיפה נאותה, דבק צריך לחשל וזרימה של הסיכה על החזה. היזהר שלא להשתמש בדבק יותר מדי.
- לרפא את הדבק עם שתי 20 התפרצויות השני של אור UV.
- מניחים את לעוף קבוע בצד וחזור. פורסים ריבועים קטנים של Kimwipe עם מלקחיים לתת לכל אחד לטוס קשור לרסן את הטיסה.
- לאחר כשעה של התאוששות, הזבובים קשור מוכנים ניסויים.
- הדבקה לא נכון עלול לפגוע ביכולתו של זבוב לבצע בזירה מגנט. לעוף כל יש לבדוק עבור סיבוב חלקה בתחילת כל ניסוי כדי להבטיח את הזבובים מודבקים כראוי. ניתן להשיג זאת על ידי החלפה דפוס פסים עם תקופה מרחבי גדול מספיק כדי לעורר תגובה חזקה optomotor [4]. אם לטוס מודבק בזווית המגרש הלא נכון או מוטה על הסיכה ביחס לציר את הגליל, את יכולה לעוף (i) לא ספין בכלל, (ii) יש טווח מוגבל של תנועה, או (iii) לסובב על עקביות מהירות. במקרים לעיל לטוס אמור להיות מושלך והוחלפו אחד חדש. אם זה פותר את הבעיה זה היה ככל הנראה מקרה של הדבקה לא תקין. (אם החלפת לטוס אינה פותרת את הבעיה, ראה פרק 2.4)
חלק 2: יישור מגנטים
יישור מגנטים (נדיר-Earth-magnets.com) כראוי יש צורך לטוס להשיג מגוון חלקה של 360 מעלות של תנועה. בצע את השלבים הבאים כמו שצריך ליישר את המגנטים.
- מגנטים הטבעת התחתונה מוחזקים אופקית על ידי שרוול פלסטיק ממוקם ישירות על גבי תא ואקום ברור (איור 1; תיאר נוספת חלק 3). מגנט המוט העליון הוא קבוע במאונך כ 3 / 4 "מעל מגנטים נמוך.
- בערך ליישר את המגנטים העליון והתחתון חזותית על ידי הצבת מגנט המוט העליון ישירות מעל נקודת המרכז של מגנטים טבעת נמוכה יותר. כדאי לצרף את המגנט העליון micromanipulator (Siskiyou Inc) להתאמת היקף בסדר.
- אפוקסי הנושא V-תכשיט (חלקים קטנים) על פני השטח התחתון של המגנט העליון כדי למזער חיכוך הסיבוב ולתקנן מיצוב לעוף.
- מניחים לעוף בזירה ולהתאים את אופקי vעמדת ertical של המגנט העליון עד לטוס יכולים חלקה בהתמדה לסובב 360 מעלות בציר לסבסב. לעוף כל יש לבדוק עבור סיבוב חלקה בתחילת כל ניסוי כדי להבטיח את המגנטים מיושרים כראוי וכי סיכות הפרט minutien אינם פגומים (ראה פרק 1.11). אם מגנטים לא מיושרים כראוי את הזבוב יכול (i) לא ספין בכלל (ii) יש טווח מוגבל של תנועה (iii) לסובב במהירויות עקביים. אם הבעיה נפתרה על ידי החלפת לטוס עם אחד חדש, זה היה ככל הנראה בשל בעיה הדבקה (ראה פרק 1). אם הבעיות הללו קיימים לטוס כל, סביר להניח בעיה עם יישור של מגנטים התאמה נוספת יידרש.
- אזהרה: בעת ששיחק עם נדיר מגנטים האדמה יכול להיות כיף, הם מסוכנים מאוד. תוצאות שימוש לרעה בציוד פגום ו / או קטין נזק גופני. לנקוט זהירות רבה עם מגנטים אלו עדיין לזלזל בקלות מפתה.
חלק 3: משלוח ריח
- מערכת המסירה ריח מבוסס על אחד שתואר לעיל [5] הוא החלק הקשה ביותר כדי לייעל (איור 1). זה דורש הרבה סבלנות, ניסוי וטעייה. בצע שלבים אלה כדי להשיג מעקב ריח יציב.
- ההגדרה הראשונית של מערכת ריח דורש ריצה צר מד צינורות טפלון (חלקים קטנים) של גז מרבב (סייבל Systems International) את מנהג מים / ריח צלוחיות בנוי. יציאה של צלוחיות אלה מתחבר ישירות ליציאת צינורות תת עורי באמצעות צינורות טפלון אותו.
- תא ואקום ברור אקריליק ממוקמת מתחת לזירה כדי לתמוך מגנטים. אנו משתמשים צינור 4 מ"מ זכוכית רכוב מתחת לעוף המחובר לתא ריק כדי להביא את הוואקום פתיחה קרובה לטוס ולהקטין את הקוטר של הפתח.
- מניחים לעוף קשור לזירה באמצעות מלקחיים.
- הפעל את ריח אטרקטיבי (חומץ תפוחים עובד היטב), וכן לוודא ויזואלית לטוס המסילה ריח. אם הזבוב נראה שאין העדפה של ריח, בצע את שלושת השלבים. זה עשוי לדרוש כמה זבובים, וניסויים שונים.
- לשנות את מיקום הנמל ריח עד לטוס מופיע כדי לעקוב אחר הריח. אנו רכוב ליציאות ריח על micromanipulators (Siskiyou Inc) ואת מיקומו 4 מ"מ קדמית הגבי ו 3mm אל ראשו של זבוב.
- התאם את קצב הזרימה ההמונית עד לטוס מופיע כדי לעקוב אחר הריח. ההגדרות שלנו 7ml/min (סייבל מערכות הבינלאומי MFC-4).
- התאם את קצב הזרימה של ואקום עד לטוס מופיע כדי לעקוב אחר הריח. אנו קובעים את קצב זרימת ואקום 13l/min באמצעות וסת זרימה (קול בן הזוג). הערה: ואקום בניין קווי האספקה עשויים להשתנות לאורך זמן גורמת לתנודות מבנה נוצה. זה עשוי להיות שימושי כדי לחבר משאבת ואקום חיצוני הרגולטור תזרים התנאים זרם בלתי פוסק ואקום.
- לאחר המיקום של הנמל ספיקות נקבעים, מעת לעת לעבור בין אדי מים לבין מתן אדי הריח באמצעות להחלפה באמצעות מרבב גז חזותית לוודא לטוס רק המסילה כאשר ריח ריח פועל. מדי פעם, ריח שיורית בתוך הנמל ריח יכול לעורר מעקב ריח כאשר הריח כבוי. זה יכול להתבטל מבלי להסיר את יציאת ריח ממוצבת היטב על ידי ממלא את המזרק עם צינורות אתנול איסוף זה על קצה משלוח עם Kimwipe. באמצעות אוויר דחוס, מכה כל אתנול הנותרים החוצה ולהמשיך בניסויים.
נציג תוצאות:
כאשר הפעולות הן בעקבות נכונה שני דברים יש לשים לב. ראשית, תחת קבוע גירויים חזותיים מסתובב זבוב קשור להציב OMT צריך לסובב חלקה 360 מעלות בציר לסבסב. "הבקר המשומר" מסתובב (נקרא הקפיצות האלה) אופייניים של התנהגות מפנה ספונטני בהיעדר גירויים חזותיים קבועים. אם זבובים כנראה לא יכול לסובב בצורה חלקה, הדבקה לא תקין (ראה חלק 1) ו - מגנטים misaligned ניתן להאשים (ראה חלק 2). שנית, כאשר ריח מופעלת, צריך לטוס בראש לכיוון הריח. כאשר ריח כבוי, צריך לטוס saccade באופן ספונטני ללא עדיפות לתפקיד בודד בזירה. אם זבובים לא פעיל המסלול פלומת ריח, עמדת הנמל ריח, קצב זרימת אוויר ו / או את קצב הזרימה ואקום עשוי להזדקק התאמה (ראה פרק 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קשירה זבובים לעורר מעקב ריח יציבה בזירה זו היא פשוטה יחסית. זה דורש, תרגול סבלנות ניסוי וטעייה. חלקים רבים של הזירה זה יכול להיות מותאם יותר או להחליף להניב וריאציות הפוטנציאל הניסיוני. לדוגמה, גרסאות חדשות יותר של החדר ריק הם הרבה יותר קטנים ולאפשר יותר מרחב מתחת לזירה. כמו כן, הכוח וסוג נדיר הארץ מגנטים יכולים להיות מגוונים מעט יציאות ריח נוסף ניתן להוסיף ולהגדיל את מספר סוגי ריח ו / או ריכוזי מנוצל ניסויים. נציין כי כל הווריאציות ציוד ידרוש אופטימיזציה מחויטת. כפי שתואר כאן, OMTA מאפשר למשתמשים לבחון את ההשפעה של רמזים חזותיים על לוקליזציה ריח. מגוון רחב של גירויים חזותיים יכול להיות מוצג עם מערכת פאנל LED כאשר יחד עם צדדיות ויכולת הרחבה של מערכת המסירה ריח המערכת מציעה את הפוטנציאל לחקור visuo-הריח אינטגרציה ברמות שונות. מערכת זו גם מוסיפה מספר הולך וגדל של מבחני התנהגות כמותי תסיסנית, במיוחד לאפיון התנהגות של מבוגרים מעופפים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מימון הניתן על ידי הקרן הלאומית למדע (MF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooling Stage | Teca | LHP-300CP | |
| Brass Cooling Block | Custom Made | ~4 x 8 x 2cm | |
| Sarcophagus | Custom Made | Contact us for details | |
| UV-Activated Glue | Kemxert corp | KOA300 | 1oz bottle lasts years |
| Panel System | Caltech | http://www.dickinson.caltech.edu/panels | [4] |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Lower Ring Magnets | Rare-earth-magnets.com | NSN0615 | 5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125" |
| Upper Rod Magnet | Rare-earth-magnets.com | NSN0750 | 0.125" x 1" |
| V-Jewel Bearing | Small Parts, Inc. | VJ-0469-01 | |
| MFC-4 Flow Regulators | Sable Systems International | ||
| Gas Multiplexer | Sable Systems International | ||
| Teflon Tubing | Small Parts, Inc. | STT-20-C | |
| 20 Gauge Hypodermic Tubes | Small Parts, Inc. | HTX-20R-06 | |
| Glass Tubing | 4mm o.d. | ||
| Vacuum Flow Regulator | Cole-Parmer | EW-32464-52 |
References
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Tammero, L. F., Dickinson, M. H. Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila. J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).
