Summary
여기 우리는 어떻게 밧줄 후각 자기 - 밧줄 (OMT) 기기에서 플라이를 설명합니다. 우리는 희토류 자석 및 악취 포트 및 최적의 냄새 추적을 달성하기 위해 자극 전달 및 진공 흡입 모두 질량 흐름 속도를 설정할 수를 정렬하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
그것은 곤충들이 바람 스트림의 제목을 안정화시키기 위해 시각적 단서를 사용하는 것이 여러 해 동안 명확되었습니다. 많은 동물이 바람에 실시 냄새를 추적할 수 있습니다. 맞바람의 등, 영상 안정화는 냄새 추적에 직접 에이즈 추적. 그러나 후각 신호를 직접 바람의 단서에서 독립적으로 시각 추적 행동에 영향을합니까? 또한, neurophysiology 및 Drosophila에서 후각의 neurobehavioral 유전학 연구의 최근 홍수가 훨씬 더 기술적으로 세련되고 양적 행동 assays 동기가있다. 여기, 우리는 원래 좁은 판상 흐름 냄새 plumes과 무대를 갖춘하여 시력 실험 고안 자기 테더 시스템을 수정했습니다. 비행기는 작은 강철 핀 접착하고 자유롭게 편주 수 있도록 자기 분야에서 일시 중지되었습니다. 작은 직경의 음식 냄새 plumes은 배고픈 파리로 안정적인 추적을 도출, 비행의 머리 아래로 이동합니다. 여기서 우리는 자석을 정렬 악취 플륨을 고안하고, 안정적인 냄새 추적을 확인, tethering의 중요한 역학에 중점을두고 있습니다.
Protocol
소개
OMT는 "가상 플륨 시뮬레이터"를 통합할 수 있도록 설계된 자기 테더 시스템 [1]의 적응이다. 다음 프로토콜은 설명 방법을 제대로 테더 빠르다 (1 부)과 자석 (2 부) 및 질량 흐름 규제 악취 전달 시스템 (Part3)을 설정하는 전략을 제공합니다. 여기에서 설명한 내용이 특정 시스템에 최적화된이며 다른 기술 사양과 구성 요소에 따라 다를 수 있습니다.
1 부 : Tethering의 파리
여기에서 설명한 tethering에 대한 단계는 많은 이전의 연구와 유사합니다 [2]하지만, OMT에 사용하기 위해 적응 [3]. 적절한 tethering는 강력하고 반복적인 실험 실험을 보장하기 위해 중요합니다. 조심 tethering의 중요성은 overstated 수 없습니다.
- 4-6일 게시물 eclosion을 날아 수집 4~6시간 그들을 굶어. kimwipe은 탈수를 방지하기 위해 foodless 유리병에 물을 moistened 놓습니다.
- 작은 유리병에 병에서 파리의 배치를 전송하고 섭씨 약 4도 정도에서 설정 펠티어 냉각 단계에서 황동 블록에 삽입. 적정 온도는 약 30 초 내에 파리를 anesthetizes.
- 냉각 단계의 차가운 표면에 파리를 정렬하십시오. 젖은 Kimwipe은 표피에서 지속적인 냉각과 수분 위킹을 보장합니다. tethering에 대한 가장 큰 여자를 선택합니다.
- 좋은 브러시를 사용하여 하나의 야생 타입 여성 과일 비행을 수용하기 위해 모양 사용자 지정 - 내장 관의 위치에 하나의 파리 밀어.
그림 1.
그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오. - 우리는 micromanipulator에 장착된 자석 막대와 minutien 핀 (벌금 과학 도구)를 위치. 핀은 무딘 끝이 단지 두 날개 사이에 머리 뒤에 지느러미 근육을 건드리면 이러한 정렬하는 것입니다. 머리에 눈을 향해 볼 때 핀 완벽하게 수직으로해야합니다. 파리와 핀 사이의 '롤'의 비록 작은 금액은 묵인할 수 없습니다. 핀과 신체의 긴 축 사이의 사이드 뷰 각도가 수평선 (그림 1)에 상대적인 30 도의 코를 접속 각도로해야합니다. 참고 : 자석 밧줄에 최적의 작업은 핀을 짧게 길이로 줄어들 수 할 수 있습니다. 이것은 서스펜션 자석 사이의 거리에 전적으로 달려 있습니다.
- minutien 핀이 정렬되면, minutien 핀의 뭉툭한 끝에 UV - 활성 접착제 (ElectroLite 코프)의 작은 방울을 적용하는 얇은 강철 와이어를 사용합니다.
- 접착제의 비말 그냥 머리 위의 파리의 흉부를 만지는 있도록 핀을 조작. 적절한 드롭 크기, 접착제 어닐링해야하며 흉부에 핀의 흐름. 너무 많은 접착제를 사용하지 않도록주의하십시오.
- 자외선의 두 20초 파열로 접착제 치료.
- 옆으로 고정 파리를 놓고 반복합니다. Kimwipe 작은 광장을 얇게하고 집게로 비행을 억제하기 위해 각 곁에 비행을 제공합니다.
- 복구 한 시간 후, 닿는 파리 실험을 준비하고 있습니다.
- 부적 절한 gluing는 자석 분야에서 수행하는 비행의 능력을 방해 수 있습니다. 모든 비행은 비행이 제대로 접착되도록하기 위해 모든 실험의 시작 원활한 회전을위한 확인하여야한다. 이것은 강한 optomotor 응답을 이끌어하기 위해 충분히 큰 공간 기간 줄무늬 패턴을 회전하여 수행할 수 있습니다 [4]. 비행이 잘못된 피치 각도로 접착하거나 롤 축에 대하여 핀에 졌다면, 즉시 수 있습니다 (I)하지 전혀 스핀하고, (ii) 운동의 제한 범위를 가지고, 또는 (iii) 일관성에 회전 속도. 위의 경우에는 즉시 폐기되어야하고 새로 교체. 이 문제를 해결하는 경우가 대부분 부적 절한 gluing의 경우되었습니다. (파리를 교체해도 문제가 해결되지 않으면, 부 2.4 참조)
2 부 : 자석 정렬
자석 (희토류 - magnets.com) 정렬하면 제대로 동작의 부드러운 360도 범위를 달성하기 위해 비행을 위해 필요합니다. 제대로 자석을 정렬하려면 다음 단계를 수행하십시오.
- 낮은 링 자석은 플라스틱 슬리브에 의해 수평으로 개최하고 맑은 진공 챔버 위에 직접 배치됩니다 (그림 1, 제 3의 자세한 설명). 위쪽 막대 자석은 낮은 자석 위에 수직으로 약 3 / 4 "고정됩니다.
- 대략 직접 낮은 고리 자석의 중앙 지점 위의 상단 막대 자석을 배치하여 시각 위턱과 아래턱에 자석을 맞춥니다. 괜찮아, 규모 조정 micromanipulator (시스키유 주)에 상단 자석을 첨부하는 데 유용합니다.
- 에폭시는 상단 자석의 아래쪽 표면에 V - 보석 베어링 (소형 부품)는 회전 마찰을 최소화하고 비행 위치를 표준화합니다.
- 경기장에서 비행기를 놓고 수평 및 V를 조정날 때까지 상단에 자석의 ertical 위치는 원활하고 꾸준히 편주 축에서 360도 회전시킬 수 있습니다. 모든 비행은 자석이 올바르게 정렬되고 개별 minutien의 핀이 (부 1.11 참조) 손상되지 않도록 모든 실험의 시작 원활한 회전을위한 확인하여야한다. 자석이 제대로 날아 있습니다 (I)하지 전혀 회전 정렬되지 않은 경우 (2) 운동의 제한 범위 (III)이 일치하지 판매율에서 회전합니다. 문제가 새로 비행을 대체하여 해결하는 경우, 그것은 (1 부 참조) 대부분 gluing 문제로 인해되었습니다. 이러한 문제는 모든 비행을 위해 존재한다면, 그것은 가능성 자석 추가적인 조정이 필요합니다의 정렬에 문제가 있습니다.
- 경고 : 재미있을 수있는 희귀한 지구 자석과 함께 즐기면서, 그들은 매우 위험합니다. 손상된 장비 및 / 또는 가벼운 신체적 상해의 결과를 오용. 이러한 유혹 아직 쉽게 과소 평가 자석과 극단주의 운동.
파트 3 : 냄새 배달
- 악취 전달 시스템이 이전에 설명한 하나를 기반으로 [5]하고 최적화하는 가장 힘든 부분은 (그림 1)입니다. 그것은 인내와 재판과 - 오류가 많이 필요합니다. 안정적인 냄새 추적을 달성하려면 다음 단계를 수행하십시오.
- 악취 시스템의 초기 셋업은 사용자 정의 지어진 물 / 냄새 유리병에 가스 멀티플렉서 (사블 시스템 국제)에서 협궤 테플론 튜브 (소형 부품)를 실행해야합니다. 이러한 튜브의 콘센트는 동일한 테플론 튜브를 사용하여 피하 포트 튜브에 직접 연결됩니다.
- 명확한 아크릴 진공 챔버는 자석을 지원하기 위해 무대 아래에 위치합니다. 우리는 비행을 가까이 개방 진공을 가지고 있으며 개방의 직경을 줄이기 위해 진공 챔버에 연결된 비행 아래 장착된 4mm 유리관을 사용합니다.
- 포셉를 사용하여 무대에 닿는 파리를 놓습니다.
- 매력적인 냄새 (애플 시더 식초가 잘 작동), 그리고 시각 비행은 그 냄새를 추적하는지 확인을 켭니다. 파리는 냄새에 대한 선호를 사용하지 않으려면 나타나는 경우, 다음 세 단계를 따르십시오. 이것은 몇 파리, 여러 시련을 요구할 수 있습니다.
- 파리는 냄새를 추적하기 위해 나타날 때까지 악취 포트의 위치를 조정합니다. 우리는 파리의 머리에 냄새 micromanipulators에 포트 (시스키유 주)와 위치 4mm 지느러미와 3mm 앞쪽에를 탑재.
- 파리는 냄새를 추적하기 위해 나타날 때까지 질량 유량을 조정하십시오. 우리의 설정은 7ml/min (사블 시스템 국제 MFC - 4).
- 파리는 냄새를 추적하기 위해 나타날 때까지 진공의 흐름 속도를 조정합니다. 우리는 흐름 레귤레이터 (콜 파머)를 사용 13l/min에서 진공 흐름 속도를 설정할 수 있습니다. 참고 : 빌딩 진공 공급 라인이 플륨 구조의 변화를 일으키는 시간이 지남에 따라 변동될 수 있습니다. 그것은 일정한 진공 흐름 조건에 대한 유량 조절기에 외부 진공 펌프를 연결하는 것이 유용할 수 있습니다.
- 항구와 흐름 속도의 위치가 설정되면, 정기적으로 가스 멀티플렉서를 사용하여 전환을 사용하여 구현 물 증기 및 냄새의 증기 사이에 스위치와 시각 냄새가 때 비행은 그 냄새를 추적하는지 확인합니다. 때때로 그 냄새 포트 내부의 잔류 냄새 그 냄새가 꺼져 냄새 추적을 이끌어내는 수 있습니다. 이것은 에탄올과 피하 튜브를 작성하고 Kimwipe와 함께 배달 끝에 수집하여 제대로 위치 악취 포트를 제거하지 않고 제거하실 수 있습니다. 압축 공기를 사용하여 남아있는 에탄올을 날려와 실험을 재개.
대표 결과 :
다음 단계가 제대로 준수하면 두 가지가 관찰해야합니다. 첫째, 지속적인 회전 시각적 자극이 아래 OMT에 배치 닿는 파리가 원활하게 편주 축에서 360도 회전한다. "손으로"전환에 (saccades라고도 함) 지속적인 시각적 자극의 부재에서 자연 터닝 동작의 특징입니다. 파리는 분명히 원활하게 회전 수없는 경우, 부적 절한 gluing (1 부 참조)하고 고르지 자석이 (2 부 참조) 비난 수 있습니다. 둘째, 그 냄새가 켜져있을 때, 즉시 그 냄새의 방향으로 머리를해야합니다. 냄새가 해제되면 파리가 무대에 하나의 위치에 대한 설정을 자발적 saccade해야합니다. 파리 적극적으로 악취 플륨, 악취 포트의 위치, 공기 흐름 속도 및 / 또는 진공 흐름 속도를 추적하지 않는 경우 (파트 3 참조) 조정이 필요할 수 있습니다.
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Discussion
파리 Tethering이 분야에서 안정적인 냄새 추적을 도출하는 것은 비교적 간단합니다. 그것은 연습, 인내와 시행 착오가 필요합니다. 이 분야의 많은 부분이 더욱 최적화된 또는 실험적인 잠재력에 변화를 얻을 수로 대체 수 있습니다. 예를 들어, 진공 챔버의 최신 버전이 훨씬 작은하며 무대 아래에 더 많은 공간을 허용합니다. 또한, 강도와 희토류 자석의 종류가 약간 변경될 수 있으며, 추가로 악취 포트는 냄새 유형 및 / 또는 실험에 활용 농도의 수를 증가하여 추가할 수 있습니다. 우리는 장비에 변화가 맞게 최적화를 필요로됩니다. 여기에 설명한 바와 같이, OMTA 사용자가 악취 지방화에 대한 시각적 단서의 효과를 테스트할 수 있습니다. 시스템이 여러 수준에서 visuo - 후각 통합을 탐험하는 잠재력을 제공하는 악취 전달 시스템의 다목적 및 확장성과 함께 할 때 시각적 자극의 다양한는 LED 패널 시스템을 제공하고 있습니다. 이 시스템은 특히 비행 어른의 동작을 특성화를위한, Drosophila에 대한 양적 행동 assays의 증가로 추가됩니다.
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Acknowledgments
기금은 국립 과학 재단 (MF)에 의해 제공됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooling Stage | Teca | LHP-300CP | |
| Brass Cooling Block | Custom Made | ~4 x 8 x 2cm | |
| Sarcophagus | Custom Made | Contact us for details | |
| UV-Activated Glue | Kemxert corp | KOA300 | 1oz bottle lasts years |
| Panel System | Caltech | http://www.dickinson.caltech.edu/panels | [4] |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Lower Ring Magnets | Rare-earth-magnets.com | NSN0615 | 5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125" |
| Upper Rod Magnet | Rare-earth-magnets.com | NSN0750 | 0.125" x 1" |
| V-Jewel Bearing | Small Parts, Inc. | VJ-0469-01 | |
| MFC-4 Flow Regulators | Sable Systems International | ||
| Gas Multiplexer | Sable Systems International | ||
| Teflon Tubing | Small Parts, Inc. | STT-20-C | |
| 20 Gauge Hypodermic Tubes | Small Parts, Inc. | HTX-20R-06 | |
| Glass Tubing | 4mm o.d. | ||
| Vacuum Flow Regulator | Cole-Parmer | EW-32464-52 |
References
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Tammero, L. F., Dickinson, M. H. Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila. J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).
