Summary
Здесь мы опишем, как трос летать в обонятельной магнитной троса (ОМТ) аппарата. Мы опишем, как выровнять редкоземельных магнитов и запах портов, и как установить ставки массового расхода для доставки стимул и вакуумного всасывания для достижения оптимального отслеживания запах.
Abstract
Это стало ясно в течение многих лет, что насекомые используют визуальные сигналы для стабилизации их движется в потоке ветра. Многие животные дорожку запахов производится на ветру. Таким образом, визуальные стабилизации против ветра отслеживания непосредственно помогает при запах слежения. Но обонятельные сигналы непосредственно влиять на визуальное поведение отслеживания независимо от ветра сигналы? Кроме того, недавнее наводнение исследования нейрофизиологии и генетики нейроповеденческие обоняния у дрозофилы побудило все более технически сложных поведенческих и количественного анализа. Здесь мы изменили магнитную тросовой системы изначально разработана для зрения эксперименты по оснащению арене с узкими перьями ламинарного потока запах. Летать приклеивается к булавки стали и приостановлено в магнитное поле, которое позволяет ему свободно рыскания. Малый диаметр перья пищи запах направлены вниз над головой летают с, вызывая стабильную отслеживание голодные мухи. Здесь мы сосредоточимся на критической механики привязывать, выравнивая магнитов, разработка запах шлейф, и подтверждения стабильного слежения запах.
Protocol
Введение
ОМТ является адаптацией магнитного тросовой системы [1] разработаны с возможностью "виртуальный симулятор шлейфа". Следующие протоколы будут объяснять, как правильно троса мух (часть 1) и обеспечить стратегию для создания магнитов (Часть 2) и массового расхода регулируемой системы доставки запах (Part3). Информация, описанная здесь, оптимизированных для данной системы и может изменяться для компонентов с другими техническими характеристиками.
Часть 1: модема мух
Шаги для привязывания, описанные здесь, как и во многих предыдущих исследованиях [2], но адаптирован для использования в OMT [3]. Правильное привязывать имеет решающее значение для обеспечения надежных и воспроизводимых экспериментальных испытаний. Важность тщательного привязывать не может быть переоценена.
- Сбор мухи 4-6 дней после eclosion и голодать им в течение 4-6 часов. Место kimwipe смоченной в воде в foodless флакон для предотвращения высыхания.
- Передача партии мух от бутылки небольшой пузырек и вставить его в медный блок на этапе охлаждения Пельтье установлена на уровне около 4 градусов по Цельсию. Надлежащей температуре обезболивает мух в течение примерно 30 секунд.
- Сортировать летает на холодной поверхности охлаждения. Влажной Kimwipe обеспечивает постоянное охлаждение и влаги влагу от кутикулы. Выберите крупнейших самок для привязывания.
- Использование тонкой кистью, нажмите одну летать в позиции в заказ саркофаг формы для размещения одного дикого типа женщин плодовой мухи.
Рисунок 1.
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию рисунка. - Мы позиционируем minutien контактный (штрафы науки Tools) с магнитным стержнем установлен на микроманипулятора. Штифт должен быть выровнены так, что тупым концом касается спины грудной клетки сразу за голову между двумя крыльями. Вывод должен быть идеально вертикальными, если смотреть в лоб на глазах. Даже небольшое количество ролла »между летать и пин-код не может быть терпимо. Вид сбоку угол между контактный и длинной оси тела должны быть на нос до угла в 30 градусов по отношению к горизонту (рис. 1). Примечание: Для оптимальной работы в магнит троса, контакты, возможно, должны быть урезаны в сторону более коротких длин. Это будет полностью зависеть от расстояния между магнитами подвески.
- Как только контактный minutien выравнивается, использование тонкой стальной проволоки применить небольшую каплю УФ-активированного клея (электролит Corp), чтобы тупой конец контактный minutien.
- Манипулирование контактный клей так капля коснется грудной клетки мухи прямо над головой. При правильном размер капли, клей должен отжига и поток от вывода на грудную клетку. Будьте осторожны, чтобы не использовать слишком много клея.
- Cure клея с двумя 20-секундный всплесков ультрафиолетового излучения.
- Место фиксированной лететь в сторону и повторите. Фрагмент небольшие квадраты Kimwipe и щипцами дать по одному на каждый привязан летать сдерживать полет.
- Через час на восстановление, привязанный мухи готовы к экспериментам.
- Неправильное склеивания может препятствовать способности летать, чтобы выполнить в магнит арене. Каждый летать должны быть проверены на плавное вращение в начале каждого эксперимента для обеспечения мухи правильно склеены. Это может быть достигнуто поворотом полосатый рисунок с достаточно большим пространственным периодом, чтобы выявить сильные ответы оптомоторных [4]. Если лететь приклеивается под неправильным углом смолы или наклонен на вывод в отношении крена оси, муха может (я) не вращается вовсе, (II) имеют ограниченный диапазон движения, или (III) вращаются с несовместимыми скорость. В приведенных выше случаях летать следует выбросить и заменить новой. Если это решает проблему это было, скорее всего случае неправильного склеивания. (Если заменить летать не решает проблему, см. часть 2.4)
Часть 2: Выравнивание магниты
Выравнивание магниты (редкоземельные-magnets.com) должным образом необходимо лететь в достижении гладкие 360 Диапазон степени движения. Выполните следующие шаги, чтобы должным образом выровнять магнитов.
- Нижний магниты кольца проводятся по горизонтали пластмассовой втулкой и помещаются непосредственно на вершине ясно вакуумной камере (рис. 1, описанная далее в п. 3). Верхняя стержневой магнит крепится вертикально примерно 3 / 4 "выше нижней магнитов.
- Грубо выровнять верхний и нижний магниты визуально, помещая верхний магнит прут прямо над центральной точкой нижнего магнитов кольца. Это полезно приложить верхний магнит для микроманипулятора (Сиския Inc) для тонкой настройки масштаба.
- Эпоксидные V-жемчужина подшипник (мелкие детали) на нижней поверхности верхней магнитом, чтобы минимизировать вращательного трения и стандартизировать летать позиционирования.
- Место летать на арене и отрегулировать горизонтальное и Vertical положение верхнего магнита до летать может плавно и устойчиво вращаться на 360 градусов по оси рыскания. Каждый летать должны быть проверены на плавное вращение в начале каждого эксперимента для обеспечения магниты выровнены и что отдельные контакты minutien не повреждены (см. Часть 1.11). Если магниты должным образом не согласованы летать может (я) не вращается вовсе (II) имеют ограниченный диапазон движения (III) вращаются на несовместимых скоростей. Если проблема не решается заменой летать с новым, оно, скорее всего, из-за склеивания задачи (см. часть 1). Если эти проблемы существуют для каждого летать, это может быть связано с выравниванием магнитов и дальнейшая регулировка не требуется.
- Внимание: во время игры с редкоземельных магнитов может быть весело, они очень опасны. Злоупотребление приводит к поврежденного оборудования и / или легких телесных повреждений. Будьте чрезвычайно осторожны с этим заманчивым, но легко недооценивать магнитов.
Часть 3: Запахи доставки
- Система запах доставки основана на одном описано ранее [5] и жесткая часть оптимизации (рис. 1). Это требует много терпения и методом проб и ошибок. Выполните следующие шаги для достижения стабильного слежения запах.
- Начальная настройка системы требует запаха работает узкой колеи тефлоновой трубки (мелкие детали) из газовой мультиплексор (Соболь Systems International), чтобы обычай построен воды / запах ампул. Выход из этих флаконов подключается непосредственно к порту подкожных труб с использованием тех же трубы тефлона.
- Ясно вакуумной камеры акриловое находится под арену для поддержки магнитов. Мы используем 4 мм стеклянной трубки установлен ниже летать подключен к вакуумной камере довести вакуум открытия ближе к лету и уменьшить диаметр отверстия.
- Место привязаны летать на арену использованием щипцов.
- Включите привлекательным запахом (яблочный уксус хорошо работает), и визуально убедиться, что летать треков запах. Если летать, похоже, никакого предпочтения запахов, выполните следующие три шага. Для этого может потребоваться несколько мух, и несколько испытаний.
- Отрегулируйте положение запах порт до летать появляется отслеживать запах. Мы установили запах портов микроманипуляторами (Сиския Inc) и позиционируется 4мм спинной и 3 мм впереди голову мухи.
- Отрегулируйте массового расхода, пока летают появляется отслеживать запах. Наши настройки 7ml/min (Соболь Systems International MFC-4).
- Отрегулируйте расход вакууме до летать появляется отслеживать запах. Мы установили скорость потока в вакуумной 13l/min использованием регулятор расхода (Cole Пармер). Примечание: Строительство линии вакуумной питания может колебаться с течением времени вызывают колебания шлейф структуры. Это может быть полезно для подключения внешнего вакуумного насоса на регулятор расхода для постоянных условиях потока вакуума.
- Как только положение портов и расхода устанавливаются, периодически переключаться между доставки водяной пар и запах паров использования переключаемых использованием газа мультиплексор и визуально убедиться, что летают только треки запах, когда запах идет. Иногда, остаточный запах внутри запах порт может вызвать запах слежения, когда запах выключен. Это могут быть устранены без удаления запаха правильно расположен порт, заполнив подкожных труб с этанолом и сбор ее на доставку заканчиваются Kimwipe. Использование сжатого воздуха, удар все оставшиеся из этанола и возобновить эксперименты.
Представитель Результаты:
Когда эти шаги будут правильно две вещи должны быть соблюдены. Во-первых, под постоянным вращающимся визуальные стимулы привязаны летать помещен в ОМТ должны вращаться плавно на 360 градусов по оси рыскания. "Jerky" оказывается (так называемый саккад) характерны для спонтанного поведения превращаясь в отсутствие постоянных зрительных раздражителей. Если мухи, по-видимому не вращаются плавно, неправильного склеивания (см. часть 1) и несогласованность магниты могут быть виноваты (см. часть 2). Во-вторых, когда запах включен, муха должна головы в сторону запаха. Когда запах выключен, муха должна саккады спонтанно, без предпочтения какому-либо единой позиции на арене. Если мухи не активно отслеживать запах шлейф, позиция запах порт, скорость воздушного потока и / или скорости вакуумного потока может нуждаться в корректировке (см. часть 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модема мух и вызывая стабильную отслеживание запаха в этой области относительно проста. Это требует практики, терпения и проб и ошибок. Многие элементы этой арене может быть дополнительно оптимизированы или заменены на выход изменений в экспериментальной потенциал. Например, новые версии вакуумной камере намного меньше, и позволяют больше места ниже арене. Кроме того, прочность и тип редкоземельные магниты могут быть изменены незначительно и дополнительные порты запаха могут быть добавлены в увеличении числа типов запаха и / или концентрации, используемых в экспериментах. Заметим, что любые изменения в оборудовании потребуется с учетом оптимизации. Как описано здесь, OMTA позволяет пользователям проверить влияние визуальные подсказки на запах локализации. Разнообразные визуальные стимулы могут быть представлены с системой светодиодной панели и в сочетании с универсальностью и расширяемость системы доставки запах система предлагает потенциал для изучения зрительно-обонятельная интеграции на многих уровнях. Эта система также добавляет к увеличению количественных поведенческие тесты для дрозофилы, в частности, для характеристики поведения летающих взрослых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Финансовые средства, предоставленные Национальным научным фондом (МФ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooling Stage | Teca | LHP-300CP | |
| Brass Cooling Block | Custom Made | ~4 x 8 x 2cm | |
| Sarcophagus | Custom Made | Contact us for details | |
| UV-Activated Glue | Kemxert corp | KOA300 | 1oz bottle lasts years |
| Panel System | Caltech | http://www.dickinson.caltech.edu/panels | [4] |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Lower Ring Magnets | Rare-earth-magnets.com | NSN0615 | 5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125" |
| Upper Rod Magnet | Rare-earth-magnets.com | NSN0750 | 0.125" x 1" |
| V-Jewel Bearing | Small Parts, Inc. | VJ-0469-01 | |
| MFC-4 Flow Regulators | Sable Systems International | ||
| Gas Multiplexer | Sable Systems International | ||
| Teflon Tubing | Small Parts, Inc. | STT-20-C | |
| 20 Gauge Hypodermic Tubes | Small Parts, Inc. | HTX-20R-06 | |
| Glass Tubing | 4mm o.d. | ||
| Vacuum Flow Regulator | Cole-Parmer | EW-32464-52 |
References
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Tammero, L. F., Dickinson, M. H. Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila. J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).
