Summary
Qui si descrivono come legare una mosca in un apparato olfattivo magnetico-legare (OMT). Noi descriviamo come allineare la magneti in terre rare e le porte degli odori, e come impostare le portate sia per la consegna stimolo e di aspirazione a vuoto per raggiungere il monitoraggio ottimale degli odori.
Abstract
E 'stato chiaro da molti anni che gli insetti utilizzano segnali visivi di stabilizzare la loro voce in un flusso di vento. Molti animali gli odori portata in pista dal vento. Come tale, la stabilizzazione visiva di bolina monitoraggio direttamente aiuti nel monitoraggio degli odori. Ma i segnali olfattivi influenzano direttamente il comportamento visivo di tracciamento indipendente di spunti vento? Inoltre, il diluvio recenti della ricerca sulla neurofisiologia e della genetica neurocomportamentale dell'olfatto in Drosophila ha motivato test comportamentali sempre più tecnicamente sofisticate e quantitativi. Qui, abbiamo modificato un sistema magnetico tether originariamente ideato per gli esperimenti visione dotando l'arena con pennacchi strette a flusso laminare odore. Una mosca è incollata ad un piccolo perno in acciaio e sospesa in un campo magnetico che permette di imbardata liberamente. Di piccolo diametro pennacchi odori degli alimenti sono diretti verso il basso sopra la testa al volo s, suscitando monitoraggio stabile da una mosca fame. Qui ci concentriamo sulla meccanica critica di tethering, allineando i magneti, definire il pennacchio odore, e confermando il monitoraggio stabile odore.
Protocol
Introduzione
L'OMT è un adattamento di un sistema di legare magnetica [1] progettato per incorporare un "simulatore virtuale pennacchio". I seguenti protocolli spiegherà come legare correttamente le mosche (Parte 1) e fornire le strategie per creare i magneti (Parte 2) e la massa del flusso regolato sistema di erogazione degli odori (Part3). Le informazioni qui descritto è ottimizzato per questo particolare sistema e possono variare per i componenti con le altre specifiche tecniche.
Parte 1: vola Tethering
I passaggi per legare qui descritte sono simili a molti studi precedenti [2], ma adattati per l'uso in OMT [3]. Tethering corretta è fondamentale per garantire solide prove sperimentali e ripetibili. L'importanza di legare attento non può essere sopravvalutata.
- Raccogliere vola 4-6 giorni dopo l'eclosion e farli morire di fame per 4-6 ore. Posizionare un kimwipe inumidito con acqua nel flacone senza cibo per prevenire l'essiccamento.
- Trasferimento di un lotto di mosche da una bottiglia di una piccola fiala e inserirlo in un blocco di ottone su un palco di raffreddamento Peltier fissato a circa 4 gradi Celsius. La temperatura corretta anestetizza le mosche entro circa 30 secondi.
- Ordina le mosche sulla superficie fredda della fase di raffreddamento. Un Kimwipe umido garantisce un raffreddamento costante e assorbimento dell'umidità dalla cuticola. Selezionare la più grande femmine per il tethering.
- Utilizzando un pennello fine, spingere una mosca in posizione nel custom-built a forma di sarcofago per ospitare un unico selvatico moscerino della frutta femmina tipo.
Figura 1.
Clicca qui per vedere la versione ingrandita della figura. - Noi posizione un perno minutien (Multe Strumenti scienza) con una bacchetta magnetica montata su un micromanipolatore. Il perno è allineato in modo tale che l'estremità smussata tocca il torace dorsale appena dietro la testa tra le due ali. Il perno deve essere perfettamente verticale quando viene visualizzato a testa alta verso gli occhi. Anche una piccola quantità di 'roll' tra il volare e il pin non può essere tollerato. La vista laterale angolo tra il perno e l'asse longitudinale del corpo deve essere di un naso-up angolo di 30 gradi rispetto all'orizzonte (Fig. 1). Nota: Per un funzionamento ottimale nella pastoia magnete, il pin può essere necessario tagliati a lunghezze. Questo dipenderà interamente dalla distanza tra i magneti sospensione.
- Una volta che il perno minutien è allineato, usare un sottile filo d'acciaio per applicare una piccola goccia di colla UV-attivati (Electrolite Corp) alla fine smussato del perno minutien.
- Manipolare il perno delle gocce di colla in modo che il torace tocca al volo appena sopra la testa. Con la dimensione goccia corretta, la colla deve temprare e il flusso dal perno sul torace. Fare attenzione a non usare troppa colla.
- Cura la colla con due 20 secondi scoppia di luce UV.
- Posizionare il volano fisso da parte e ripetere. Fetta piazzette di Kimwipe e con una pinza dare uno a ciascuno volare legato a frenare volo.
- Dopo un'ora di recupero, le mosche legato sono pronti per gli esperimenti.
- Incollaggio improprio può ostacolare la capacità di una mosca a svolgere nel campo magnetico. Ogni volo deve essere controllato per rotazione regolare all'inizio di ogni esperimento per assicurare le mosche siano incollati. Questo può essere ottenuto dalla rotazione di un modello a strisce con un periodo sufficientemente ampio spazio per ottenere risposte optomotor forte [4]. Se il volo è incollato a l'angolo di inclinazione sbagliata o inclinato sul pin con rispetto all'asse di rollio, la mosca non possono (i) girare a tutti, (ii) hanno una gamma limitata di movimento, o (iii) ruotare a incoerente velocità. Nei casi di cui sopra al volo deve essere eliminata e sostituita con una nuova. Se questo risolve il problema era probabilmente un caso di incollaggio improprio. (Se la sostituzione al volo non risolve il problema, vedere la Parte 2.4)
Parte 2: Allineare i magneti
Allineando i magneti (terre rare-magnets.com) è necessario per la corretta volare per raggiungere una vasta liscia a 360 gradi di movimento. Attenersi alla seguente procedura per allineare correttamente i magneti.
- I magneti ad anello inferiore sono tenuti orizzontalmente da un collare in plastica e posto direttamente sopra una camera a vuoto chiaro (Fig. 1, descritta più avanti nella parte 3). Il magnete asta superiore è fissato in verticale di circa 3 / 4 "sopra i magneti più basso.
- Circa allineare il magnete superiore e inferiore visivamente posizionando il magnete superiore asta direttamente sopra il punto centrale dei magneti dell'anello inferiore. E 'utile per fissare il magnete superiore ad un micromanipolatore (Siskiyou Inc.) per la regolazione scala fini.
- Epossidica un V-gioiello del cuscinetto (parti piccole) sulla superficie inferiore del magnete superiore per ridurre al minimo l'attrito di rotazione e standardizzare il posizionamento volare.
- Mettere una mosca in campo e regolare la orizzontale e vertical posizione del magnete superiore fino al volo possa agevolmente e in costante rotazione di 360 gradi lungo l'asse di imbardata. Ogni volo deve essere controllato per rotazione regolare all'inizio di ogni esperimento per assicurare i magneti sono correttamente allineati e che singoli pin minutien non siano danneggiati (vedi Parte 1.11). Se i magneti non sono allineati correttamente al volo non possono (i) girare a tutti i (ii) hanno una gamma limitata di movimento (iii) ruotare a velocità incoerente. Se il problema è risolto sostituendo al volo con uno nuovo, è stato molto probabilmente dovuto ad un problema di incollaggio (vedi parte 1). Se questi problemi esistono per ogni volo, è probabile un problema con l'allineamento dei magneti e di ulteriori aggiustamenti sarà richiesto.
- Attenzione: durante il gioco con magneti in terre rare può essere divertente, sono molto pericolosi. L'abuso si traduce in attrezzature danneggiate e / o minori lesioni personali. Prestare la massima attenzione a questi magneti allettante e facilmente sottovalutato.
Parte 3: Consegna Odore
- Il sistema di erogazione odore è basato su quello descritto in precedenza [5] ed è la parte più difficile da ottimizzare (Fig. 1). Si richiede molta pazienza e tentativi ed errori. Seguire questa procedura per ottenere il monitoraggio stabile odore.
- Il set-up iniziale del sistema odore richiede l'esecuzione di stretta misura tubi in Teflon (parti piccole) dal gas multiplexer (Sable Systems International) per l'acqua su misura / odore fiale. La presa di queste fiale si collega direttamente ai tubi porta il ipodermico utilizzando il tubo stesso in Teflon.
- Una chiara camera a vuoto acrilico è posizionato sotto l'arena per supportare i magneti. Usiamo un 4 millimetri tubo di vetro montato sotto il volano collegato alla camera a vuoto per portare il vuoto di apertura più vicino al volo e ridurre il diametro dell'apertura.
- Mettere una mosca legato nell'arena con pinze.
- Accendere un odore attraente (aceto di sidro di mele funziona bene), e verificare visivamente che la mosca tracce l'odore. Se la mosca sembra avere alcuna preferenza per l'odore, seguire i prossimi tre passi. Questo può richiedere vola diversi, e diverse prove.
- Regolare la posizione del porto odore fino a quando il volo sembra seguire l'odore. Abbiamo montato le porte odore di micromanipolatori (Siskiyou Inc.) e posizionati quattro millimetri anteriore dorsale e 3mm a testa della mosca.
- Regolare la portata di massa fino a quando il volo sembra seguire l'odore. Le nostre impostazioni sono 7ml/min (Sable Systems International MFC-4).
- Regolare la portata del vuoto fino a quando il volo sembra seguire l'odore. Abbiamo impostato la portata vuoto a 13l/min utilizzando un regolatore di flusso (Cole Parmer). Nota: Costruzione linee di alimentazione a vuoto possono variare nel tempo causando variazioni nella struttura pennacchio. Può essere utile per collegare una pompa esterna a vuoto per il regolatore di flusso per le condizioni di flusso costante di vuoto.
- Una volta che la posizione del porto e le portate sono impostati, periodicamente passare da una fornitura di vapore acqueo e vapori odore utilizzando una commutabile tramite un multiplexer gas e verificare visivamente che la mosca tracce solo l'odore, quando l'odore è acceso. Occasionalmente, odore residuo all'interno del porto odore può provocare monitoraggio odore è l'odore è spento. Ciò può essere evitato senza rimuovere la porta odore posizionata correttamente compilando i tubi ipodermico con etanolo e raccolta alla fine consegna con un Kimwipe. Con aria compressa, soffiare ogni residuo di etanolo fuori e riprendere gli esperimenti.
Rappresentante dei risultati:
Quando questi passaggi sono seguiti correttamente due cose devono essere osservati. In primo luogo, sotto costante stimoli visivi a rotazione una mosca legato posto nel OMT dovrebbe girare senza problemi a 360 gradi lungo l'asse di imbardata. "Jerky" giri (chiamati saccadi) sono caratteristici del comportamento spontaneo di svolta in assenza di costanti stimoli visivi. Se le mosche non possono ruotare apparentemente senza problemi, incollaggio improprio (vedi parte 1) e magneti allineati possano esserne la causa (cfr. parte 2). In secondo luogo, quando l'odore è acceso, il volo dovrebbe dirigersi in direzione dell'odore. Quando l'odore è spento, la mosca dovrebbe saccade spontaneamente, senza preferenza per ogni singola posizione in campo. Se vola non attivamente traccia il pennacchio odore, la posizione del porto odore, la portata d'aria e / o la portata di vuoto può avere bisogno di regolazione (cfr. parte 3).
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Discussion
Tethering mosche e suscitando monitoraggio stabile odore in questo campo è relativamente semplice. Si richiede pratica, pazienza e tentativi ed errori. Molte parti di questa arena può essere ulteriormente ottimizzato o sostituiti per produrre variazioni di potenziale sperimentale. Per esempio, le versioni più recenti della camera a vuoto sono molto più piccoli e permettere più spazio sotto l'arena. Inoltre, la forza e il tipo di magneti in terre rare può essere variato leggermente l'odore e le porte aggiuntive potrebbero essere aggiunte per aumentare il numero di tipi di odore e / o concentrazioni utilizzate negli esperimenti. Prendiamo atto che qualsiasi variazione delle attrezzature richiederanno l'ottimizzazione su misura. Come descritto qui, il OMTA consente agli utenti di testare l'effetto dei riferimenti visivi sulla localizzazione degli odori. Una grande varietà di stimoli visivi possono essere presentati con il sistema di pannelli a LED e, quando accoppiato con la versatilità e l'espandibilità del sistema di consegna odore il sistema offre la possibilità di esplorare visuo-olfattiva integrazione a vari livelli. Questo sistema aggiunge anche il crescente numero di analisi quantitativa del comportamento di Drosophila, in particolare per la caratterizzazione del comportamento degli adulti volo.
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Acknowledgments
Finanziamenti forniti dalla National Science Foundation (MF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooling Stage | Teca | LHP-300CP | |
| Brass Cooling Block | Custom Made | ~4 x 8 x 2cm | |
| Sarcophagus | Custom Made | Contact us for details | |
| UV-Activated Glue | Kemxert corp | KOA300 | 1oz bottle lasts years |
| Panel System | Caltech | http://www.dickinson.caltech.edu/panels | [4] |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Lower Ring Magnets | Rare-earth-magnets.com | NSN0615 | 5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125" |
| Upper Rod Magnet | Rare-earth-magnets.com | NSN0750 | 0.125" x 1" |
| V-Jewel Bearing | Small Parts, Inc. | VJ-0469-01 | |
| MFC-4 Flow Regulators | Sable Systems International | ||
| Gas Multiplexer | Sable Systems International | ||
| Teflon Tubing | Small Parts, Inc. | STT-20-C | |
| 20 Gauge Hypodermic Tubes | Small Parts, Inc. | HTX-20R-06 | |
| Glass Tubing | 4mm o.d. | ||
| Vacuum Flow Regulator | Cole-Parmer | EW-32464-52 |
References
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Tammero, L. F., Dickinson, M. H. Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila. J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).
