Summary
Nous décrivons ici comment attache une mouche dans un appareil olfactif magnétique attache (OMT). Nous décrivons comment aligner les aimants des terres rares et des ports d'odeur, et la façon de fixer les taux de débit massique pour les deux la livraison de relance et d'aspiration à réaliser le suivi des odeurs optimale.
Abstract
Il est clair depuis de nombreuses années que les insectes utilisent des repères visuels pour stabiliser leur tête dans un flux de vent. Beaucoup d'animaux piste des odeurs transportées par le vent. En tant que tel, la stabilisation visuelle de vent suivi directement dans le suivi des aides d'odeur. Mais ne signaux olfactifs influencer directement le comportement de suivi visuel indépendamment de signaux vent? En outre, le récent déluge de la recherche sur la neurophysiologie et la génétique du comportement neurologique de l'olfaction chez la drosophile a motivé de plus en plus techniquement sophistiqués et quantitatif des dosages de comportement. Ici, nous avons modifié un système d'ancrage magnétiques initialement conçu pour des expériences de la vision en équipant l'arène avec panache laminaire étroites odeur de flux. Une mouche est collé à une petite tige en acier et en suspension dans un champ magnétique qui lui permet de lacet librement. Petite panaches de diamètre alimentaires odeurs sont dirigés vers le bas sur la tête à la volée s, suscitant suivi stables par une mouche faim. Nous nous concentrons ici sur les mécanismes essentiels du tethering, en alignant les aimants, concevoir le panache d'odeur, l'odeur et la confirmation de suivi stable.
Protocol
Présentation
L'OMT est une adaptation d'un système d'ancrage magnétiques [1] visant à intégrer un "simulateur de panache virtuel". Les protocoles suivants expliquent comment vole ancrage correctement (partie 1) et fournir des stratégies pour la mise en place des aimants (Partie 2) et de débit massique système réglementé de livraison odeur (Part3). Les informations décrites ici sont optimisés pour ce système particulier et peut varier pour les composants avec d'autres spécifications techniques.
Partie 1: mouches Tethering
Les étapes pour attacher décrites ici sont similaires à de nombreuses études antérieures [2], mais adapté pour une utilisation dans un OMT [3]. Tethering appropriée est cruciale pour assurer robuste et reproductible des essais expérimentaux. L'importance de la fonction modem attention ne peut pas être surestimée.
- Recueillir des mouches 4-6 jours après l'éclosion et les affamer pendant 4-6 heures. Placer un Kimwipe humidifié avec de l'eau dans le flacon foodless pour éviter la dessiccation.
- Transfert d'un lot de mouches dans une bouteille d'un petit flacon et l'insérer dans un bloc de laiton sur une étape de refroidissement Peltier fixé à environ 4 degrés Celsius. La bonne température anesthésie les mouches dans les 30 secondes environ.
- Trier les mouches sur la surface froide de l'étape de refroidissement. Un Kimwipe humides assure un refroidissement constant et évacue l'humidité de la cuticule. Sélectionnez le plus important pour attacher les femelles.
- Utiliser une brosse fine, pousser une seule mouche dans une position dans le sarcophage en forme sur mesure pour accueillir une seule volée de fruits sauvages de type femelle.
Figure 1.
S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de la figure de l'. - Nous positionnons une épingle minutien (Amendes Science Tools) avec un barreau magnétique montée sur un micromanipulateur. La broche est d'être alignés de telle sorte que l'extrémité émoussée touche le thorax dorsal juste derrière la tête entre les deux ailes. La broche doit être parfaitement vertical vus de front vers les yeux. Même une petite quantité de 'roll »entre la volée et la broche ne peut pas être toléré. L'angle de vision latérale entre la broche et l'axe longitudinal du corps doit être à un angle de cabré de 30 degrés par rapport à l'horizon (fig. 1). Remarque: Pour un fonctionnement optimal dans l'attache aimant, les broches peuvent avoir besoin d'être taillés pour des longueurs plus courtes. Cela dépendra entièrement de la distance entre les aimants de suspension.
- Une fois la goupille minutien est aligné, utiliser un fil d'acier minces d'appliquer une petite goutte de colle UV-activé (Electrolite Corp) à l'extrémité émoussée de l'épingle minutien.
- Manipuler la broche afin de la gouttelette de colle touche le thorax de la mouche juste au-dessus de la tête. Avec la bonne taille de goutte, la colle doit recuit et le débit de l'épingle sur le thorax. Soyez prudent de ne pas utiliser trop de colle.
- Cure de la colle avec deux rafales 20 secondes de la lumière UV.
- Placez la volée fixe de côté et répétez. Trancher des petits carrés de Kimwipe et avec une pince en donner un à chaque mouche attachée à restreindre vol.
- Après une heure de récupération, les mouches attachés sont prêts pour des expériences.
- Collage incorrecte peut nuire à la capacité d'une mouche à effectuer dans l'arène aimant. Chaque volée doit être vérifié pour une rotation en douceur au début de chaque expérience pour assurer les mouches sont correctement collé. Ceci peut être accompli par rotation d'un motif à rayures avec une période suffisamment importante pour susciter des réponses spatiales optomoteur forte [4]. Si la mouche est collé à l'angle de tangage mal ou inclinée sur la broche par rapport à l'axe de roulis, la mouche (i) ne peut pas tourner du tout, (ii) ont une gamme limitée de mouvement, ou (iii) tournent à incompatibles vélocité. Dans le cas ci-dessus à la volée doit être jeté et remplacé par un nouveau. Si cela résout le problème le plus probable était un cas de collage inapproprié. (Si le remplacement à la volée ne résout pas le problème, voir Partie 2.4)
Partie 2: Alignement des aimants
Alignement des aimants (terres rares-magnets.com) est correctement nécessaires à la volée pour obtenir une gamme degré lisses 360 de mouvement. Suivez ces étapes pour aligner correctement les aimants.
- Les aimants anneau inférieur sont tenues horizontalement par un manchon en plastique et placé directement sur le dessus d'une chambre à vide clair (Fig. 1; décrit plus loin dans la partie 3). L'aimant tige supérieure est fixée à la verticale d'environ 3 / 4 "au-dessus des aimants inférieurs.
- Environ aligner les aimants supérieur et inférieur visuellement en plaçant l'aimant tige supérieure directement au-dessus du point central de l'anneau inférieur aimants. Il est utile de joindre l'aimant supérieur à un micromanipulateur (Siskiyou Inc) pour un réglage à échelle fine.
- Époxy un roulement V-bijou (petites pièces) sur la surface inférieure de l'aimant supérieur pour minimiser la friction de rotation et de positionnement de normaliser la mouche.
- Placez une mouche dans l'arène et d'ajuster l'horizontale et vla position VERTICALE de l'aimant supérieur jusqu'à la mouche peut en douceur et progressivement tourner sur 360 degrés dans l'axe de lacet. Chaque volée doit être vérifié pour une rotation en douceur au début de chaque expérience pour assurer les aimants sont correctement alignés et que les broches individuelles minutien ne sont pas endommagés (voir partie 1.11). Si les aimants ne sont pas correctement alignés à la volée (i) ne peut pas tourner du tout (ii) ont une gamme restreinte de mouvement (iii) tournent à des vitesses incompatibles. Si le problème est résolu en remplaçant la volée avec un nouveau, il était probablement dû à un problème de collage (voir partie 1). Si ces problèmes existent pour chaque vol, il est probablement un problème avec l'alignement des aimants et d'autres ajustements seront nécessaires.
- Attention: tout en jouant avec des aimants de terre rare peut être amusant, ils sont très dangereux. Mauvais usage des résultats dans les équipements endommagés et / ou des lésions corporelles mineures. Soyez extrêmement prudent avec ces aimants tentante pourtant facilement sous-estimée.
Partie 3: Odeur de livraison
- Le système de livraison est basé sur l'odeur celui décrit précédemment [5] et est la partie la plus difficile à optimiser (Fig. 1). Il exige beaucoup de patience et d'essai-erreur. Suivez ces étapes pour réaliser le suivi des odeurs stable.
- La mise en place initiale du système d'odeur nécessite courir voie étroite Téflon tube (petites pièces) à partir du gaz (Sable Systems International) multiplexeur intégré à la coutume de l'eau / odeur flacons. La sortie de ces flacons se connecte directement au port de tubes hypodermiques en utilisant la même tubulure en téflon.
- Une chambre à vide en acrylique transparent est placé sous l'arène pour soutenir les aimants. Nous utilisons un tube de verre de 4mm monté sous la volée relié à la chambre à vide pour amener le plus près de l'ouverture à vide à la volée et de réduire le diamètre de l'ouverture.
- Placez une mouche captif dans l'arène en utilisant une pince.
- Mettez une odeur attrayante (vinaigre de cidre de pomme fonctionne bien), et vérifier visuellement que la mouche des pistes de l'odeur. Si la mouche ne semble avoir aucune préférence pour l'odeur, suivez les trois prochaines étapes. Cela peut nécessiter plusieurs mouches, et plusieurs essais.
- Ajustez la position du port d'odeur jusqu'à ce que la mouche paraît pour suivre l'odeur. Nous avons monté les ports odeur sur micromanipulateurs (Siskiyou Inc) et positionné 4mm et 3mm dorsale antérieure à la tête de la mouche.
- Régler le débit de masse jusqu'à ce que la mouche paraît pour suivre l'odeur. Nos réglages sont 7ml/min (Sable Systems International MFC-4).
- Régler le débit de l'aspirateur jusqu'à ce que la mouche paraît pour suivre l'odeur. Nous avons fixé le débit vide à 13l/min utilisant un régulateur de débit (Cole Parmer). Note: les lignes d'alimentation du bâtiment sous vide peut fluctuer au fil du temps causant des fluctuations dans la structure du panache. Il peut être utile pour connecter une pompe à vide externe au régulateur de débit pour des conditions de débit constant sous vide.
- Une fois la position du port et les débits sont fixés périodiquement basculer entre la vapeur d'eau et de vapeur d'odeur livrer l'aide d'une commutable en utilisant un multiplexeur de gaz et de vérifier visuellement que la mouche que les pistes de l'odeur quand l'odeur est allumé. Parfois, l'odeur résiduelle à l'intérieur du port d'odeurs peuvent provoquer des odeurs de suivi lorsque l'odeur est éteint. Ceci peut être éliminé sans enlever l'odeur du port correctement positionné en remplissant des tubes hypodermiques avec de l'éthanol et la collecte sur le bout de livraison avec un Kimwipe. Utiliser l'air comprimé, souffler toute l'éthanol restant hors et de reprendre les expériences.
Les résultats représentatifs:
Lorsque ces étapes sont suivies correctement deux choses doivent être observées. D'abord, sous constante rotation des stimuli visuels attachés à une mouche placée dans l'OMT devrait tourner sans problème sur 360 degrés dans l'axe de lacet. "Jerky" tours (appelés saccades) sont caractéristiques de comportement en virage spontanée en l'absence de la constante de stimuli visuels. Si les mouches peuvent apparemment pas tourner en douceur, le collage incorrecte (voir partie 1) et les aimants peuvent être alignées à blâmer (voir partie 2). Deuxièmement, lorsque l'odeur est allumé, la mouche devrait prendre la direction de l'odeur. Lorsque l'odeur est éteint, la mouche devrait saccade spontanément avec de préférence pour aucun position unique dans l'arène. Si les mouches ne participent pas activement suivre le panache d'odeur, la position du port de l'odeur, le débit d'air et / ou le débit de vide peut nécessiter un ajustement (voir partie 3).
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Discussion
Attacher les mouches et les odeurs de suivi susciter stable dans ce domaine est relativement simple. Elle exige la pratique, de patience et de tâtonnements. De nombreuses parties de cette arène pourrait encore être optimisé ou substitué à céder variations de potentiel expérimental. Par exemple, les nouvelles versions de la chambre à vide sont beaucoup plus petits et de permettre plus d'espace ci-dessous l'arène. En outre, la force et le type d'aimants de terre rare peut être légèrement varié et les ports d'odeurs supplémentaires pourraient être ajoutés pour augmenter le nombre de types d'odeur et / ou les concentrations utilisées dans les expériences. Nous notons que toutes les variations dans les équipements, il faudra d'optimisation adaptées. Comme décrit ici, le OMTA permet aux utilisateurs de tester l'effet des repères visuels sur la localisation d'odeur. Une grande variété de stimuli visuels peuvent être présentés avec le système de panneaux LED et lorsqu'elle est associée à la polyvalence et l'évolutivité du système de prestation d'odeur, le système offre la possibilité d'explorer l'intégration visuo-olfactive à plusieurs niveaux. Ce système contribue également à l'augmentation du nombre de tests quantitatifs de comportement pour la drosophile, en particulier pour caractériser le comportement des adultes volants.
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Acknowledgments
Le financement fourni par la National Science Foundation (MF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooling Stage | Teca | LHP-300CP | |
| Brass Cooling Block | Custom Made | ~4 x 8 x 2cm | |
| Sarcophagus | Custom Made | Contact us for details | |
| UV-Activated Glue | Kemxert corp | KOA300 | 1oz bottle lasts years |
| Panel System | Caltech | http://www.dickinson.caltech.edu/panels | [4] |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Lower Ring Magnets | Rare-earth-magnets.com | NSN0615 | 5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125" |
| Upper Rod Magnet | Rare-earth-magnets.com | NSN0750 | 0.125" x 1" |
| V-Jewel Bearing | Small Parts, Inc. | VJ-0469-01 | |
| MFC-4 Flow Regulators | Sable Systems International | ||
| Gas Multiplexer | Sable Systems International | ||
| Teflon Tubing | Small Parts, Inc. | STT-20-C | |
| 20 Gauge Hypodermic Tubes | Small Parts, Inc. | HTX-20R-06 | |
| Glass Tubing | 4mm o.d. | ||
| Vacuum Flow Regulator | Cole-Parmer | EW-32464-52 |
References
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Tammero, L. F., Dickinson, M. H. Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila. J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).
