Summary
Hier beschreiben wir, wie man eine Fliege Leine in einer olfaktorischen magnetisch-Leine (OMT) Apparat. Wir beschreiben, wie die seltenen Erden Magneten und Geruch Häfen, und wie Massenströme für den Reiz Lieferung und Vakuumsauger, um eine optimale Geruch Tracking zu erreichen gesetzt auszurichten.
Abstract
Es ist seit vielen Jahren klar, dass Insekten visuelle Hinweise nutzen, um ihre Position in einem Wind-Strom zu stabilisieren. Viele Tiere zu verfolgen Gerüche in den Wind. Als solche visuellen Stabilisierung der Wind Tracking direkt Hilfen in Geruch Tracking-Systems. Aber olfaktorischen Signale direkt beeinflussen visuelle Nachverfolgung Verhalten unabhängig von Wind cues? Auch die jüngste Flut von Untersuchungen über die Neurophysiologie und neurologische Genetik des Geruchssinns bei Drosophila immer mehr technisch anspruchsvolle und quantitative Verhalten Assays motiviert. Hier modifizierten wir eine magnetische Halteseil, das ursprünglich für das Sehen Experimente durch die Ausrüstung der Arena mit schmalen Laminar-Flow-Geruch Federn entwickelt. Eine Fliege ist auf einem kleinen Stahlstift geklebt und aufgehängt in einem Magnetfeld, dass sie frei yaw ermöglicht. Kleiner Durchmesser Lebensmittel Geruch Federn sind nach unten über die Fliege den Kopf gerichtet, entlocken stabil Tracking von einem hungrigen fliegen. Hier haben wir auf die kritische Mechanik der Anbindehaltung zu konzentrieren, die Ausrichtung der Magnete, die Ausarbeitung der Geruch Fahne, und bestätigen Stallgeruch Tracking-Systems.
Protocol
Einführung
Die OMT ist eine Adaption eines magnetischen Leine-System [1] entwickelt, um eine "virtuelle Feder-Simulator" zu integrieren. Folgende Protokolle werden erklären, wie man richtig Leine fliegt (Teil 1) und stellen Strategien für den Aufbau des Magneten (Teil 2) und Massenstrom geregelt Geruch Abgabesystem (Part3). Die hier beschriebenen Informationen wird für dieses spezielle System optimiert und kann für Bauteile mit anderen technischen Spezifikationen variieren.
Teil 1: Tethering Fliegen
Die Schritte für die Anbindehaltung hier beschriebenen ähnlich vielen früheren Studien [2], das speziell für den Einsatz in einer OMT [3]. Proper Anbindehaltung ist entscheidend, um robuste und reproduzierbare experimentelle Studien zu gewährleisten. Die Wichtigkeit eines sorgsamen Tethering kann nicht überbewertet werden.
- Sammeln Sie fliegt 4-6 Tage post Schlüpfen und verhungern sie für 4-6 Stunden. Legen Sie eine Kimwipe mit Wasser angefeuchtet in der foodless Fläschchen, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Übertragen einer Charge von Fliegen aus einer Flasche zu einem kleinen Fläschchen und legen Sie sie in einer Messing-Block auf einem Peltier-Kühlung Bühne bei etwa 4 Grad Celsius eingestellt. Die richtige Temperatur betäubt die Fliegen innerhalb von ca. 30 Sekunden.
- Sortieren Sie die Fliegen an der kalten Oberfläche des Kühlstufe. Ein feuchtes Kimwipe sorgt für eine konstante Kühlung und Feuchtigkeitstransport von der Nagelhaut. Wählen Sie die größten Weibchen Anbindehaltung.
- Mit einem feinen Pinsel, drücken Sie eine Fliege in die richtige Position in der custom-built Sarkophag geformt, um einen einzigen Wildtyp weibliche Fruchtfliege unterzubringen.
Abbildung 1.
Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen. - Wir Position ein minutien pin (Fines Science Tools) mit einem Magnetstab an einem Mikromanipulator befestigt. Der Stift ist so ausgerichtet, dass das stumpfe Ende des dorsalen Thorax berührt unmittelbar hinter dem Kopf zwischen den beiden Flügeln werden. Der Stift sollte perfekt vertikal, wenn Kopf-on zu den Augen angesehen. Schon eine kleine Menge von 'roll' zwischen dem Fliegen und Pin kann nicht toleriert werden. Die Seitenansicht Winkel zwischen dem Stift und der Längsachse des Körpers sollte mit einer Nase-up Winkel von 30 Grad relativ zum Horizont (Abb. 1). Hinweis: Für einen optimalen Betrieb in den Magneten Leine, die Stifte müssen eventuell auf kürzere Längen zugeschnitten werden. Dies hängt ganz von der Entfernung zwischen der Aussetzung Magneten.
- Sobald die minutien pin ausgerichtet ist, mit einem dünnen Stahlseil um einen kleinen Tropfen UV-aktivierbare Kleber (Electrolite Corp), um das stumpfe Ende des minutien pin gelten.
- Bearbeiten Sie die Pin so den Leim Tropfen berührt die Fliege Thorax gerade über dem Kopf. Mit der richtigen Tröpfchengröße, sollte der Kleber Glühen und Flow aus dem Stift auf den Brustkorb. Seien Sie vorsichtig, nicht zu viel Kleber verwenden.
- Cure den Leim mit zwei 20 Sekunden bricht der UV-Licht.
- Legen Sie die feste fliegen beiseite und wiederholen. Scheiben kleine Quadrate Kimwipe und mit einer Pinzette geben eine für jeden angebundenen fliegen in die Flucht zu beschränken.
- Nach einer Stunde der Erholung werden die angebundenen Fliegen bereit für Experimente.
- Unsachgemäße Kleben behindern kann eine Fliege in der Lage, in der Magnet-Arena durchführen. Jeder fliegen sollte für eine gleichmäßige Drehung zu Beginn eines jeden Versuchs, um sicherzustellen, das Fliegen richtig verklebt überprüft werden. Dies kann durch Drehen ein Streifenmuster mit einem ausreichend großen räumlichen Periode starken optomotorischen Reaktionen auszulösen erreicht werden [4]. Wenn die Fliege an der falschen Neigungswinkel geklebt oder gekippt auf den Stift in Bezug auf die Längsachse, die fliegen können (i) gar nicht drehen, (ii) eine eingeschränkte Beweglichkeit, oder (iii) bei inkonsistenten drehen Geschwindigkeit. In den genannten Fällen die Fliege muss entsorgt und ersetzt werden durch eine neue. Wenn das Problem dadurch behoben wurde wahrscheinlich ein Fall von unsachgemäßer Kleben. (Wenn anstelle der Fliege nicht das Problem löst, siehe Teil 2.4)
Teil 2: Ausrichten der Magnete
Ausrichten der Magnete (Seltene-Erden-magnets.com) richtig für das Fliegen zu einem glatten 360-Grad-Bewegungsfreiheit zu erreichen. Befolgen Sie diese Schritte richtig ausrichten Magneten.
- Der untere Ring Magnete sind horizontal durch eine Kunststoff-Hülse gehalten und wird direkt auf der Spitze eines klaren Vakuumkammer (Abb. 1; beschrieben weiter in Teil 3). Die obere Stange Magnet ist vertikal um etwa 3 / 4 "oberhalb des unteren Magneten fixiert.
- Rund Richten Sie den oberen und unteren Magneten visuell, indem die obere Stange Magneten direkt über dem Mittelpunkt der unteren Ring-Magneten. Es ist sinnvoll, den oberen Magneten an einem Mikromanipulator (Siskiyou Inc.) legen für die Feinskalierung.
- Epoxy eine V-Saphirlager (Small Parts) an der Unterseite des oberen Magneten zu minimieren Rotationsreibung und zu standardisieren fliegen Positionierung.
- Platzieren Sie eine Fliege in die Arena und die horizontale und vertikale Position des oberen Magneten, bis die fliegen können ruhig und stetig um 360 Grad drehen in die Hochachse. Jeder fliegen sollte für eine gleichmäßige Drehung zu Beginn jedes Experiment überprüft werden, um sicherzustellen, dass die Magneten richtig ausgerichtet sind und dass einzelne minutien Pins nicht beschädigt werden (siehe Teil 1,11). Wenn die Magnete nicht richtig ausgerichtet sind die fliegen können (i) überhaupt nicht drehen (ii) eine eingeschränkte Beweglichkeit (iii) bei inkonsistenten Geschwindigkeiten zu drehen. Wenn das Problem durch Austausch der Fliege mit einer neuen Lösung ist, war es wahrscheinlich wegen einer Verklebung Problem (siehe Teil 1). Wenn diese Probleme für jede Fliege existieren, ist es wahrscheinlich ein Problem mit der Ausrichtung der Magnete und weitere Anpassung erforderlich.
- Achtung: beim Spielen mit Seltenerd-Magneten kann Spaß machen, sie sind sehr gefährlich. Missbrauch führt zu beschädigten Geräten und / oder einfache Körperverletzung. Seien Sie besonders vorsichtig mit diesen verlockenden noch leicht unterschätzt Magneten.
Teil 3: Odor Lieferung
- Der Geruch Lieferung System basiert auf einer zuvor beschrieben basiert [5] und ist der härteste Teil zu optimieren (Abb. 1). Es erfordert viel Geduld und Trial-and-error. Befolgen Sie diese Schritte, um stabile Geruch Tracking zu erreichen.
- Die ersten Set-up des Geruchs System erfordert laufende Schmalspurbahn Teflon-Schlauch (Kleinteile) aus dem Gas-Multiplexer (Sable Systems International), die custom built Wasser / Geruch Fläschchen. Der Ausgang dieser Flaschen wird direkt an den subkutanen Port-Rohre mit gleichem Teflon-Schlauch.
- Eine klare Acryl Vakuumkammer wird unter der Arena, um den Magneten zu unterstützen positioniert. Wir verwenden ein 4mm Glasrohr unter der Fliege an der Vakuumkammer montiert, um das Vakuum Eröffnung näher an die Fliege zu bringen und zur Verringerung der Durchmesser der Öffnung.
- Legen Sie die Anbindung an eine Fliege in die Arena mit einer Pinzette.
- Schalten Sie ein attraktives Geruch (Apfelessig gut funktioniert), und visuell zu überprüfen, dass die Fliege den Geruch Tracks. Wenn die Fliege scheint keine Vorliebe für den Geruch haben, folgen die nächsten drei Schritte. Dies kann mehrere Fliegen, und mehrere Studien.
- Passen Sie die Position des Geruchs-Anschluss, bis die Fliege erscheint, um den Geruch zu verfolgen. Wir bestiegen den Geruch Ports auf Mikromanipulatoren (Siskiyou Inc.) positioniert und 4mm Rücken-und 3mm anterior der Fliege den Kopf.
- Passen Sie den Massenstrom, bis die Fliege erscheint, um den Geruch zu verfolgen. Unsere Einstellungen sind 7ml/min (Sable Systems International MFC-4).
- Stellen Sie den Durchfluss des Vakuums, bis die Fliege erscheint, um den Geruch zu verfolgen. Wir setzen das Vakuum Durchflussmenge bei 13l/min mit einem Durchflussregler (Cole Parmer). Hinweis: Building Vakuum Versorgungsleitungen im Laufe der Zeit schwanken verursacht Schwankungen in plume Struktur. Es kann nützlich sein, um eine externe Vakuumpumpe, die Durchflussregler Verbindung für konstante Saugleistung Bedingungen.
- Sobald die Position des Hafens und die Volumenströme eingestellt werden, in regelmäßigen Abständen zwischen liefert Wasserdampf und Geruch Dampf-Schalter mit einer schaltbaren mit einem Gas-Multiplexer und visuell zu überprüfen, dass die Fliege nur Spuren der Geruch, wenn der Geruch ist. Gelegentlich kann Restgeruch innerhalb der Geruch Port entlocken Geruch Verfolgung, wenn der Geruch ausgeschaltet ist. Dies kann ohne Entfernen der richtig positioniert Geruch Hafen durch das Ausfüllen der subkutanen Röhren mit Ethanol und sammeln sie auf dem Lieferschein Ende mit einem Kimwipe beseitigt werden. Mit Druckluft, Schlag verbleibende Ethanol aus und wieder Experimente.
Repräsentative Ergebnisse:
Wenn diese Schritte korrekt befolgt werden zwei Dinge zu beachten. Zunächst unter ständigem Drehen visuelle Reize die Anbindung an eine Fliege in der OMT platziert sollte problemlos um 360 Grad drehen in die Hochachse. "Jerky" wird (so genannte Sakkaden) sind charakteristisch für spontane Drehverhalten in Abwesenheit der ständigen visuellen Reizen. Wenn Fliegen können offenbar nicht reibungslos drehen können bei unsachgemässer Verklebung (siehe Teil 1) und falsch ausgerichtete Magneten daran schuld sein (siehe Teil 2). Zweitens, wenn der Geruch eingeschaltet ist, sollte die fliegen in Richtung des Geruchs Kopf. Wenn der Geruch ausgeschaltet ist, sollte die Fliege spontan Sakkade ohne Präferenz für eine einzelne Position in der Arena. Wenn Fliegen nicht aktiv verfolgen Sie den Geruch Fahne, die Position des Geruchs-Port, der Luftdurchsatz und / oder das Vakuum Durchfluss muss möglicherweise angepasst werden (siehe Teil 3).
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Discussion
Tethering Fliegen und entlocken Stallgeruch Tracking in diesem Bereich ist relativ einfach. Es erfordert Übung, Geduld und Versuch und Irrtum. Viele Teile dieser Arena konnten weiter optimiert werden oder ersetzt, um Variationen in der experimentellen Ertragspotential. Zum Beispiel sind neuere Versionen der Vakuumkammer wesentlich kleiner und lassen mehr Platz unterhalb der Arena. Außerdem kann die Stärke und Art der Seltenen Erden-Magneten leicht variiert werden und zusätzliche Geruchs-Ports könnten hinzugefügt, um die Anzahl der Geruch Typen und / oder Konzentrationen in Experimenten verwendet zu erhöhen. Wir nehmen zur Kenntnis, dass alle Varianten in Ausstattung zugeschnitten Optimierung benötigen. Wie hier beschrieben, kann der Benutzer OMTA um die Wirkung von visuellen Hinweisen auf den Geruch Lokalisation zu testen. Eine Vielzahl von visuellen Stimuli können mit dem LED-Panel-System vorgestellt werden, und wenn mit der Vielseitigkeit und Ausbaufähigkeit der Geruch Liefersystem bietet das System das Potenzial, visuell-olfaktorischen Integration auf vielen Ebenen zu erkunden gekoppelt. Dieses System trägt auch zu der wachsenden Zahl von quantitativen Verhaltens-Assays für Drosophila, insbesondere zur Charakterisierung des Verhaltens von fliegenden Erwachsene.
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Acknowledgments
Die Finanzierung durch die National Science Foundation (MF) zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooling Stage | Teca | LHP-300CP | |
| Brass Cooling Block | Custom Made | ~4 x 8 x 2cm | |
| Sarcophagus | Custom Made | Contact us for details | |
| UV-Activated Glue | Kemxert corp | KOA300 | 1oz bottle lasts years |
| Panel System | Caltech | http://www.dickinson.caltech.edu/panels | [4] |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Lower Ring Magnets | Rare-earth-magnets.com | NSN0615 | 5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125" |
| Upper Rod Magnet | Rare-earth-magnets.com | NSN0750 | 0.125" x 1" |
| V-Jewel Bearing | Small Parts, Inc. | VJ-0469-01 | |
| MFC-4 Flow Regulators | Sable Systems International | ||
| Gas Multiplexer | Sable Systems International | ||
| Teflon Tubing | Small Parts, Inc. | STT-20-C | |
| 20 Gauge Hypodermic Tubes | Small Parts, Inc. | HTX-20R-06 | |
| Glass Tubing | 4mm o.d. | ||
| Vacuum Flow Regulator | Cole-Parmer | EW-32464-52 |
References
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Tammero, L. F., Dickinson, M. H. Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila. J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).
