Summary
ここでは、どのようにテザー嗅覚磁気テザー（OMT）装置でフライをして説明します。我々は、希土類磁石と臭気のポート、およびどのように刺激の配信と最適な臭気の追跡を実現するために真空吸引の両方の質量流量を設定することを整列する方法について説明します。
Abstract
それは虫が風の流れでその見出しを安定させるために視覚的な手がかりを使用することを長年にわたって明らかになっている。多くの動物は、風で運ばれた匂いを追跡。このように、風上の視覚的な安定は、臭気の追跡に直接補助追跡。しかし、嗅覚の信号は、直接風の手がかりから独立して視覚的な追跡の動作に影響を与えるのですか？また、ショウジョウバエの神経生理学と嗅覚の神経行動遺伝学に関する研究の最近の洪水では、これまで以上に技術的に洗練され、定量的な行動アッセイを動機としています。ここで、我々は元々狭い層流臭プルームでアリーナを搭載することにより、ビジョンの実験のために考案された磁気テザーシステムを変更。フライは小さなスチールピンに接着し、自由にヨーを可能にする磁場中に懸濁されている。小径食品の匂いのプルームは、空腹フライで安定したトラッキングを引き出す、ハエの頭の上に下向きにしている。ここでは、磁石を合わせ臭羽毛を考案し、安定的な臭気の追跡を確認、テザリングの重要なメカニズムに焦点を当てる。
Protocol
はじめ
OMTは、"仮想プルームシミュレーター"を組み込むために設計された[1]磁気テザーシステムの適応です。次のプロトコルは、どのように適切にテザーのハエ（パート1）を説明し、磁石（パート2）とマスフロー規制臭気デリバリーシステム（その3）を設定するための戦略を提供します。ここで説明する情報は、この特定のシステム用に最適化されており、他の技術仕様を持つコンポーネントによって異なる場合があります。
パート1：テザリングのハエ
ここで説明するテザリングをするための手順は、多くの先行研究と類似している[2]しかし、OMT法での使用に適合[3]。適切なテザリングは、堅牢で再現性の実験的試行を確保することが重要です。慎重にテザリングの重要性は誇張することはできません。
- 4-6日の後の羽化を飛ぶ収集し、4〜6時間のためにそれらを飢えさせる。キムワイプで乾燥を防ぐために、食べ物のないバイアルに水で湿らせた置きます。
- 小さなバイアルに瓶からハエのバッチを転送し、摂氏約4度で設定されたペルチェ冷却ステージ上に真鍮のブロックに挿入します。適切な温度は約30秒以内にハエをanesthetizes。
- 冷却ステージの冷たい表面上のハエをソートします。湿らせたキムワイプはキューティクルから一定の冷却と水分の上がりを確実にします。テザリングのための最大の女性を選択してください。
- 細かいブラシを使用して、単一の野生型雌ミバエを収容する形特注の石棺の位置に単一のフライを押してください。
図1。
図の拡大バージョンをご覧いただくにはこちらをクリックしてください。 - 我々は、マイクロマニピュレータに取り付けられた磁気ロッドとminutienピン（罰金科学のツール）を置きます。ピンは、平滑末端がちょうど2つの翼の間に頭の後ろに背胸部に触れるように配置されることです。目に向かって正面から見たときにピンが完全に垂直でなければなりません。フライとピンの間に"ロール"のであっても少量を許容することはできません。ピンと体の長軸の間にサイドビューの角度は水平線（図1）に対して相対的に30度の機首アップの角度になっているはず。注：磁石のテザーで最適な動作では、ピンはケーブル長を短くするためにトリミングする必要があります。これにより、サスペンションの磁石間の距離に完全に依存します。
- minutienのピンが整列されると、minutienピンの平滑末端にUV -活性化接着剤（ElectroLiteコーポレーション）の小滴を適用するために細い鋼線を使用してください。
- 接着剤の液滴がちょうど頭の上にハエの胸部に触れるようにピンを操作します。適切なドロップサイズで、接着剤は、アニールすべきと胸部の上にピンから流れます。あまりにも多くの接着剤を使用しないように注意してください。
- UV光の2つ20秒のバーストで接着剤を治す。
- 固定フライを脇に置き、繰り返し。キムワイプの小さな四角をスライスし、鉗子で飛行を抑制するために、各係留飛行するものを与える。
- 回復の一時間後に、テザーハエは、実験の準備が整いました。
- 不適切な接着には、磁石の分野で実行するハエの能力を妨げる可能性があります。すべてのハエは、ハエが適切に接着されるように、すべての実験の開始時に滑らかな回転のためにチェックする必要があります。これは、強力な微細運動の応答を引き出すために十分に大きな空間的な周期で縞模様を回転させることによって達成することができます[4]。ハエが間違っピッチ角に接着またはロール軸を基準にしてピンに傾いていると、ハエ5月は、（i）の動きの制限された範囲を持っている、または（iii）一貫性のないで回転（ii）全く回転しない速度。上記のケースではハエを破棄し、新しいものに置き換えられます。この問題が解決した場合、それはおそらく不適切な接着のケースだった。 （フライを交換しても問題が解決しない場合は、第2.4参照）
パート2：磁石の位置を揃える
磁石（希土類- magnets.com）を揃えることが適切動きのスムーズな360度の範囲を達成するためにフライが必要である。適切に磁石を整列させるには、次の手順に従います。
- 下のリング磁石は、プラスチックスリーブで水平に保持し、明確な真空チャンバーの上に直接配置されます（図1、パート3で詳しく説明）。上部の棒磁石を下側磁石の上に垂直に約3 / 4"固定されています。
- ほぼ直接下部リング磁石の中心点の上に上部の棒磁石を置くことによって視覚的に上下の磁石の位置を合わせます。それは、微細調整のためにマイクロマニピュレータ（シスキユー社）に、上部磁石を添付すると便利です。
- エポキシ回転摩擦を最小限にし、フライの位置を標準化するために、上部磁石の底面上にV -宝石軸受（スモールパーツ）。
- アリーナでフライを配置し、水平方向とvを調整するフライまで、上部磁石のertical位置は、円滑かつ着実にヨー軸に360度回転させることができます。すべてのハエは、磁石が適切に整列されており、個々のminutienピンは（パート1.11参照）損傷していないことを保証するためにすべての実験の開始時に滑らかな回転のためにチェックする必要があります。磁石が適切にフライを整列されていない場合5月は、（i）すべての（ⅱ）で回転しない動きの制限された範囲を（iii）の一貫性のない速度で回転する必要があります。問題は新しいものとフライを交換することによって解決されている場合、それは（パート1を参照）最も可能性の高い接着の問題によるものであった。これらの問題は、すべてのハエのために存在する場合、それは可能性が高い磁石とさらに調整が必要とされるのアラインメントの問題です。
- 警告：楽しいことができる希土類磁石で遊んでいる間、彼らは非常に危険です。破損した機器及び/またはマイナー身体的危害の結果を悪用。これらの魅力的な、まだ簡単に過小評価して磁石では細心の注意を払ってください。
パート3：臭配信
- 臭気の配信システムは、前述のいずれかに基づいている[5]および最適化するために過酷な部分（図1）である。それは忍耐と試行錯誤の多くを必要とします。安定した臭いの追跡を実現するためには、次の手順に従います。
- 臭気のシステムの初期セットアップは、カスタム構築された水/臭バイアルへのガスマルチプレクサ（セーブルシステムズインターナショナル）から狭いゲージテフロンチューブ（スモールパーツ）を実行している必要があります。これらのバイアルの出口は、同じテフロンチューブを使用して皮下ポートのチューブに直接接続します。
- 透明なアクリルの真空チャンバは、磁石をサポートするために、アリーナの下に配置されている。私たちは、ハエに近い開き真空を持参し、開口部の直径を減らすために、真空チャンバに接続されているフライの下にマウントさ4ミリメートルのガラス管を使用してください。
- 鉗子を使用して舞台にテザーフライを置きます。
- 魅力的な臭気（リンゴ酢がうまく機能）をオンにし、視覚的にハエが匂いを追跡することを確認してください。フライは、匂いに対する嗜好を持っていないように見える場合は、次の3つの手順に従ってください。これは、いくつかのハエ、そしていくつかの臨床試験が必要になる場合があります。
- フライは、匂いを追跡するために表示されるまで、臭気のポートの位置を調整します。我々は、マイクロマニピュレータ上に臭気のポートをマウント（シスキユー社）とハエの頭に4ミリメートル背側および3mm前方に配置されます。
- フライは、匂いを追跡するために表示されるまで、質量流量を調整します。私たちの設定が7ml/min（セーブルシステムズインターナショナルMFC - 4）です。
- フライは、匂いを追跡するために表示されるまで、真空の流量を調整します。我々は、フローレギュレータ（コールパーマー）を使用して13l/minで真空流量を設定する。注：建物の真空供給ラインは、プルームの構造の変動を引き起こして時間の経過とともに変動する可能性があります。それは一定の真空流量条件のフローレギュレータに外付けの真空ポンプを接続するために役に立つかもしれません。
- 一度ポートの位置と流量が設定されているが、定期的にガスのマルチプレクサを使用して切替を使用し、視覚的にその場だけ臭いがオンになって臭いを追跡することを確認する水蒸気や臭気の蒸気を提供切り替える。時折、臭気のポート内部の残臭は臭いがオフになっている匂いの追跡を引き出すことができます。これは、エタノールで皮下注射管を充填し、キムワイプで配信終わりにそれを収集することにより適切な位置臭気のポートを削除せずに除去することができます。圧縮空気を使用して、残りのエタノールを吹き消すと実験を再開する。
代表的な結果：
これらの手順が正しく実行されると二つのことが観察されるべきである。最初に、一定の回転視覚刺激下OMTに配置されたテザーフライは、スムーズにヨー軸に360度回転する必要があります。 "ジャーキー"ターンは、（サッカードと呼ばれる）を一定の視覚刺激の非存在下での自発的な転換動作の特徴です。ハエが明らかにスムーズに回転できない場合、不適切な接着（パート1を参照）とずれ磁石は（パート2を参照）せいにするかもしれない。第二に、臭気がオンになっているときに、ハエは臭いの方向に向かうはずです。匂いをオフにすると、フライは競技場内の任意の単一の位置のための希望なしに自発的にサッカードがあります。ハエが積極的に臭羽毛を追跡しない場合は、臭気のポートの位置、空気の流量および/または真空の流量は、（パート3を参照）調整が必要な場合があります。
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Discussion
ハエをテザリングとこの分野で安定的な臭気の追跡を誘発することは比較的簡単です。それは練習、忍耐と試行錯誤が必要です。この分野の多くの部分は、さらに最適化や実験的な電位の変動をもたらすために代替できる場合もあります。例えば、真空チャンバ内の新しいバージョンは、はるかに小さいですし、舞台下に多くのスペースを許可する。また、希土類磁石の強さや種類が若干変化することができ、追加の臭気のポートは、実験で利用される臭気の種類の数及び/または濃度を高めるために追加される可能性があります。我々は、機器内の任意の変動が合った最適化が必要になることに注意してください。ここで説明したように、OMTAは、ユーザーが臭気のローカライズに関する視覚的な手掛かりの効果をテストすることができます。視覚刺激の多種多様なLEDパネルのシステムが表示され、ときにシステムが多くのレベルでvisuo -嗅覚統合を検討する可能性を提供する臭気の配信システムの汎用性と拡張性で結合することができます。このシステムはまた、特に飛行大人の振る舞いを特徴づけるために、ショウジョウバエのための定量的な行動アッセイの増加数に追加されます。
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Acknowledgments
国立科学財団（MF）で提供される資金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooling Stage | Teca | LHP-300CP | |
| Brass Cooling Block | Custom Made | ~4 x 8 x 2cm | |
| Sarcophagus | Custom Made | Contact us for details | |
| UV-Activated Glue | Kemxert corp | KOA300 | 1oz bottle lasts years |
| Panel System | Caltech | http://www.dickinson.caltech.edu/panels | [4] |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Lower Ring Magnets | Rare-earth-magnets.com | NSN0615 | 5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125" |
| Upper Rod Magnet | Rare-earth-magnets.com | NSN0750 | 0.125" x 1" |
| V-Jewel Bearing | Small Parts, Inc. | VJ-0469-01 | |
| MFC-4 Flow Regulators | Sable Systems International | ||
| Gas Multiplexer | Sable Systems International | ||
| Teflon Tubing | Small Parts, Inc. | STT-20-C | |
| 20 Gauge Hypodermic Tubes | Small Parts, Inc. | HTX-20R-06 | |
| Glass Tubing | 4mm o.d. | ||
| Vacuum Flow Regulator | Cole-Parmer | EW-32464-52 |
References
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Tammero, L. F., Dickinson, M. H. Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila. J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).
