Summary
A continuación se describe la manera de atar una mosca en un aparato olfativo magnético de sujeción (OMT). Se describe la forma de alinear los imanes de tierras raras y los puertos de olor, y la forma de fijar las tasas de flujo de masa, tanto para la entrega de estímulos y succión al vacío para lograr el seguimiento de olor óptimo.
Abstract
Ha quedado claro desde hace muchos años que los insectos usan señales visuales para estabilizar su título en una corriente de viento. Muchos animales seguimiento de los olores llevado por el viento. Por lo tanto, la estabilización visual de seguimiento directamente contra el viento ayuda en el seguimiento de olor. Pero las señales olfativas directamente influyen en el comportamiento de seguimiento visual independientemente de las señales de viento? Además, el diluvio reciente de la investigación sobre la neurofisiología y la genética neuroconductual del olfato en la mosca Drosophila ha motivado a los ensayos de comportamiento cada vez más sofisticados técnicamente y cuantitativos. Aquí, hemos modificado un sistema de sujeción magnética originalmente ideado para experimentos de visión y dotar a la arena con plumas estrechas laminar olor del flujo. Una mosca está pegado a un clavo de acero pequeñas y suspendida en un campo magnético que le permite a orientarse en libertad. De diámetro pequeño plumas olor del alimento se dirige hacia abajo sobre la cabeza de la mosca de la s, provocando el seguimiento estable por un elevado de hambre. Aquí nos centramos en los mecanismos fundamentales de la inmovilización, la alineación de los imanes, diseño de la pluma de olor, el olor y la confirmación de seguimiento estable.
Protocol
Introducción
La OMT es una adaptación de un sistema de sujeción magnético [1] diseñado para incorporar un "simulador de la pluma virtual". Los siguientes protocolos se explican cómo atar moscas correctamente (Parte 1) y proporcionar estrategias para la creación de los imanes (Parte 2) y la masa de flujo de un sistema regulado de entrega olor (Parte 3). La información descrita aquí está optimizado para este sistema en particular y puede variar para los componentes con otras especificaciones técnicas.
Parte 1: moscas Tethering
Los pasos para atar descritos aquí son similares a muchos estudios anteriores [2], pero adaptada para su uso en una OMT [3]. Inmovilización adecuada es crucial para asegurar las pruebas experimentales robusta y repetible. La importancia de la inmovilización cuidado no puede ser exagerada.
- Recoger las moscas 4-6 días después de la eclosión y matarlos de hambre durante 4-6 horas. Coloque una Kimwipe humedecido con agua en el vial sin alimentos para evitar la desecación.
- La transferencia de un lote de moscas de una botella a un pequeño frasco y la inserta en un bloque de latón en una etapa de enfriamiento Peltier, aproximadamente, a 4 grados Celsius. La temperatura adecuada anestesia a las moscas en aproximadamente 30 segundos.
- Ordenar las moscas en la superficie fría de la etapa de enfriamiento. A Kimwipe húmedo garantiza una refrigeración constante y absorbe la humedad de la cutícula. Seleccione la más grande de las mujeres para atar.
- El uso de un pincel fino, empujar una sola mosca en la posición en el sarcófago de costumbre-construido en forma de dar cabida a un solo vuelo de tipo salvaje mujer de la fruta.
Figura 1.
Haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura. - Hemos puesto un alfiler minutien (multas Herramientas de la Ciencia) con una barra magnética montada sobre un micromanipulador. El pin se alinea de tal modo que el extremo romo toca el tórax dorsal justo detrás de la cabeza entre las dos alas. El PIN debe ser perfectamente vertical cuando se ve de frente hacia los ojos. Incluso una pequeña cantidad de 'rollo' entre la marcha y el pin no se puede tolerar. El ángulo de visión lateral entre el pasador y el eje largo del cuerpo debe estar en un ángulo de la nariz hasta de 30 grados sobre el horizonte (Fig. 1). Nota: Para un funcionamiento óptimo en la sujeción del imán, los pines posible que tenga que ser ajustado para tramos más cortos. Esto dependerá enteramente de la distancia entre los imanes de suspensión.
- Una vez que el pin minutien está alineado, use un alambre de acero fino para aplicar una pequeña gota de pegamento UV-activa (Electrolite Corp) con el extremo romo de la pin minutien.
- Manipular los pines por lo que la gota de pegamento toca el tórax de la mosca justo por encima de la cabeza. Con el tamaño de gota adecuado, el pegamento debe recocer y el flujo de la clavija en el tórax. Tenga cuidado de no usar pegamento demasiado.
- Curar la cola con dos ráfagas de 20 segundos de la luz UV.
- Lugar de la mosca fija a un lado y repita. Cortar pequeños cuadrados de Kimwipe y con unas pinzas dar uno a cada volar atado a frenar el vuelo.
- Después de una hora de recuperación, las moscas atadas está listo para los experimentos.
- Pegado incorrecto puede dificultar la capacidad de una mosca para llevar a cabo en el campo de imán. Cada vuelo se debe comprobar la rotación suave al comienzo de cada experimento para asegurar que las moscas están bien pegados. Esto puede lograrse mediante la rotación un patrón de rayas con un período espacial lo suficientemente grande como para provocar fuertes reacciones optomotor [4]. Si la mosca se pega en el ángulo de paso incorrecto o inclinada sobre el pin con respecto al eje de balanceo, la marcha puede (i) no giran en absoluto, (ii) tienen un rango limitado de movimiento, o (iii) giran en inconsistentes velocidad. En los casos anteriores la marcha debe ser descartado y reemplazado por uno nuevo. Si esto resuelve el problema lo más probable es un caso de encolado inadecuado. (En caso de sustitución de la marcha no resuelve el problema, consulte la Parte 2.4)
Parte 2: La alineación de los imanes
La alineación de los imanes (de las tierras raras-magnets.com) correctamente es necesario para la marcha para lograr una gama suave de 360 grados de movimiento. Siga estos pasos para alinear correctamente los imanes.
- Los imanes del anillo inferior se mantiene en posición horizontal por una funda de plástico y se colocan directamente en la parte superior de una cámara de vacío transparente (Fig. 1, describe con detalle en la parte 3). El imán de la barra superior se fija vertical de aproximadamente 3 / 4 "por encima de los imanes más bajos.
- Alrededor de alinear los imanes superiores e inferiores visual colocando el imán de la barra superior justo encima del punto central de los imanes del anillo inferior. Es útil para conectar el imán superior a un micromanipulador (Siskiyou Inc.) para el ajuste de escala fina.
- Epoxi una relación V-joya (piezas pequeñas) en la superficie inferior del imán superior para minimizar la fricción de rotación y estandarizar la posición volar.
- Coloque una mosca en la arena y ajustar la posición y vertical posición del imán superior hasta que la mosca puede fácilmente y de manera constante girar 360 grados en el eje de guiñada. Cada vuelo se debe comprobar la rotación suave al comienzo de cada experimento para asegurar que los imanes se alinean correctamente y que el individuo pines minutien no están dañados (ver Parte 1.11). Si los imanes no se alinean correctamente la marcha puede (i) no giran en absoluto (ii) tienen un rango limitado de movimiento (iii) giran a velocidades inconsistentes. Si el problema se resuelve mediante la sustitución de la marcha con una nueva, lo más probable debido a un problema de fijación (véase la Parte 1). Si estos problemas existen para cada vuelo, lo más probable es un problema con la alineación de los imanes y los nuevos ajustes serán necesarios.
- Advertencia: al jugar con imanes de tierras raras pueden ser divertidas, son muy peligrosos. Mal uso de los resultados de los equipos dañados y / o lesiones corporales leves. Tenga mucho cuidado con estos imanes tentadora pero muy fácil subestimar.
Parte 3: Entrega de olor
- El sistema de entrega se basa en el olor que se describe anteriormente [5] y es la parte más difícil de optimizar (Fig. 1). Se requiere de mucha paciencia y de ensayo y error. Siga estos pasos para lograr el seguimiento de olor a establo.
- La puesta en marcha inicial del sistema olor requiere la ejecución de vía estrecha tubería de teflón (piezas pequeñas) de los gases de multiplexor (Sable Systems International) a la hecha a la medida del agua / olor viales. La salida de estos viales se conecta directamente a los tubos hipodérmica puerto utilizando el mismo tubo de teflón.
- Una cámara de vacío de acrílico claro es colocado debajo de la arena para apoyar a los imanes. Nosotros usamos un tubo de cristal de 4 mm montado por debajo de la marcha conectada a la cámara de vacío para que el vacío de la apertura de cerca de la marcha y reducir el diámetro de la abertura.
- Coloque una mosca atada a la arena con las pinzas.
- A su vez en un olor atractivo (el vinagre de sidra de manzana funciona bien), y verificar visualmente que la marcha sigue el olor. Si la mosca no parece tener preferencia por el olor, siga los siguientes tres pasos. Esto puede requerir varias moscas, y varios ensayos.
- Ajustar la posición del puerto hasta que el olor de la mosca que parece seguir el olor. Montamos los puertos de olor en micromanipulador (Siskiyou Inc.) y se coloca 4 mm anterior dorsal y de 3 mm para la cabeza de la mosca.
- Ajustar el caudal de la masa hasta que la marcha que parece seguir el olor. Nuestros valores son 7ml/min (Sable Systems International MFC-4).
- Ajustar la velocidad de flujo del vacío hasta que la marcha que parece seguir el olor. Hemos establecido el caudal de vacío en 13l/min con un regulador de flujo (Cole Parmer). Nota: Construcción de líneas de suministro de vacío puede fluctuar con el tiempo causar fluctuaciones en la estructura de la pluma. Puede ser útil para conectar una bomba de vacío externa al regulador de flujo constante de las condiciones de vacío de flujo.
- Una vez que la posición del puerto y de los caudales se establecen, de forma periódica cambiar entre el vapor de agua y el vapor de la entrega de olor con un seleccionable mediante un multiplexor de gas y verificar visualmente que el volar sólo sigue el olor cuando el olor es el. De vez en cuando, el olor residual en el interior del puerto de olor puede provocar el seguimiento de olor cuando el olor está apagado. Esto puede ser eliminado sin eliminar el olor a puerto de la posición correcta de llenar los tubos hipodérmica con etanol y su recolección en el extremo de entrega con un Kimwipe. El uso de aire comprimido, sople para eliminar el etanol restante a cabo y continuar los experimentos.
Los resultados representativos:
Cuando estos pasos se siguen correctamente dos cosas deben ser observados. En primer lugar, en constante rotación estímulos visuales una mosca atada colocado en la OMT debe girar suavemente 360 grados en el eje de guiñada. "Espasmódicos" giros (llamados movimientos sacádicos) son característicos de la conducta espontánea de inflexión en la ausencia de la constante de estímulos visuales. Si las moscas no pueden girar suavemente al parecer, pegado inadecuada (ver Parte 1) e imanes mal alineados pueden ser los culpables (véase la Parte 2). En segundo lugar, cuando el olor está encendido, la marcha deben dirigirse en la dirección del olor. Cuando el olor se apaga, la marcha debe sacada de forma espontánea, sin preferencia por ninguna posición única en la arena. Si las moscas no se activa la pista de la pluma de olor, la posición del puerto de olor, el caudal de aire y / o la tasa de flujo de vacío puede necesitar ajuste (véase la Parte 3).
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Discussion
Atar moscas y la obtención de seguimiento olor estable en este campo es relativamente sencillo. Se requiere práctica, paciencia y ensayo y error. Muchas partes de este campo podría estar más optimizado o sustituido para producir variaciones en el potencial experimental. Por ejemplo, las nuevas versiones de la cámara de vacío son mucho más pequeños y permitir más espacio debajo de la arena. Además, la fuerza y el tipo de imanes de tierras raras se puede variar un poco y puertos adicionales olor puede ser añadido para aumentar el número de tipos de olores y / o las concentraciones utilizadas en los experimentos. Tomamos nota de que las variaciones en los equipos que requieren la optimización a medida. Como se describe aquí, el OMTA permite a los usuarios probar el efecto de los estímulos visuales en la localización de olores. Una gran variedad de estímulos visuales pueden ser presentados con el sistema de paneles LED y cuando se combina con la versatilidad y capacidad de expansión del sistema de entrega olor el sistema ofrece la posibilidad de explorar la integración viso-olfativas a muchos niveles. Este sistema también se suma al número cada vez mayor de ensayos cuantitativos del comportamiento de Drosophila, en particular, para caracterizar el comportamiento de los adultos voladores.
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Acknowledgments
Financiamiento proporcionado por la National Science Foundation (MF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cooling Stage | Teca | LHP-300CP | |
| Brass Cooling Block | Custom Made | ~4 x 8 x 2cm | |
| Sarcophagus | Custom Made | Contact us for details | |
| UV-Activated Glue | Kemxert corp | KOA300 | 1oz bottle lasts years |
| Panel System | Caltech | http://www.dickinson.caltech.edu/panels | [4] |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Lower Ring Magnets | Rare-earth-magnets.com | NSN0615 | 5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125" |
| Upper Rod Magnet | Rare-earth-magnets.com | NSN0750 | 0.125" x 1" |
| V-Jewel Bearing | Small Parts, Inc. | VJ-0469-01 | |
| MFC-4 Flow Regulators | Sable Systems International | ||
| Gas Multiplexer | Sable Systems International | ||
| Teflon Tubing | Small Parts, Inc. | STT-20-C | |
| 20 Gauge Hypodermic Tubes | Small Parts, Inc. | HTX-20R-06 | |
| Glass Tubing | 4mm o.d. | ||
| Vacuum Flow Regulator | Cole-Parmer | EW-32464-52 |
References
- Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).
- Tammero, L. F., Dickinson, M. H. Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).
- Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).
- Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).
- Frye, M. A., Dickinson, M. H. Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila. J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).
