Summary
Signaux calciques jouent un rôle clé dans de nombreux processus cellulaires, y compris l'expression des gènes, la survie et la différenciation. Ici, nous montrent comment effectuer l'imagerie calcique utilisant Fura-2 heures. Imagerie calcique est un outil précieux pour étudier la régulation du calcium intracellulaire en temps réel et de sa réglementation des cascades de signalisation.
Abstract
Imagerie calcique est une technique courante qui est utile pour mesurer les signaux de calcium dans les cellules cultivées. Les techniques d'imagerie calcique profiter de colorants indicateurs de calcium, qui sont BAPTA basé molécules organiques qui changent leurs propriétés spectrales en réponse à la fixation d'ions Ca2 +. Colorants indicateurs de calcium entrent dans deux catégories, le ratio-métrique colorants comme la Fura-2 et indo-1 et une seule longueur d'onde, comme les teintures fluo-4. Ratio-métriques colorants changer soit leur excitation ou de leurs spectres d'émission en réponse au calcium, ce qui permet la concentration de calcium intracellulaire d'être déterminé à partir du ratio d'émission de fluorescence ou d'excitation à des longueurs d'onde distinctes. Le principal avantage de l'utilisation de ratio-métrique par rapport aux sondes colorants seule longueur d'onde, c'est que le rapport signal est indépendante de la concentration de colorant, de l'intensité d'éclairage, et la longueur du chemin optique permettant la concentration de calcium intracellulaire à être déterminée indépendamment de ces artefacts. Un des indicateurs de calcium la plus commune est Fura-2, qui a un pic d'émission à 505 nm et change son pic d'excitation de 340 nm à 380 nm en réponse à la fixation du calcium. Nous décrivons ici l'utilisation de la Fura-2 pour mesurer les élévations de calcium intracellulaire dans les neurones et autres cellules excitables.
Protocol
Culture de cellules
Les cellules peuvent être cultivées en utilisant des techniques établies, mais doit être plaqué sur des lamelles en verre # 1 enduit d'un adhésif cellulaires (comme la polylysine, polyornithine ou de la laminine) pour empêcher les cellules de se détacher ni bouger pendant des expériences d'imagerie.
Solutions
Des expériences d'imagerie calcique peut être effectuée en utilisant une variété de solutions physiologiques, y compris les milieux de culture cellulaire. Il est important, cependant, de s'assurer que les solutions sont libres de rouge de phénol, ce qui augmente considérablement le fond fluorescent. Nous utilisons la solution Tyrodes, qui se fait facilement et imite le liquide céphalorachidien, et nous le compléter avec du sérum bovin 0,1% d'albumine. Nous utilisons une dépolarisation avec mM de chlorure de potassium 60-90 pour activer les canaux calciques voltage dépendants et thapsigargine 1 uM (1 mM dans le DMSO stocks) ou 2 pm ionomycine (1 mM dans le DMSO stocks) pour activer magasin exploité canaux CRAC. Il est souvent pratique pour enlever le calcium de la solution extracellulaire de montrer que les élévations de calcium sont dus à l'afflux de calcium. Lors de la suppression de calcium, il est nécessaire de maintenir la concentration totale des cations bivalents (Mg 2 + et Ca 2 +) constant. En cas de remplacement du potassium pour le sodium, il est nécessaire de maintenir l'équilibre osmotique.
Solutions Tyrodes:
| Faible taux de potassium 2 mM de Ca 2 + Tyrodes (mM) | Faible taux de potassium 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) | Haute de potassium 2 mM de Ca 2 + Tyrodes (mM) | Haute de potassium 0 Ca 2 + Tyrodes (mM) | |
| NaCl | 129 | 129 | 5 | 5 |
| KCl | 5 | 5 | 129 | 129 |
| CaCl2 | 2 | 0 | 2 | 0 |
| MgCl2 | 1 | 3 | 1 | 3 |
| Le glucose | 30 | 30 | 30 | 30 |
| Hepes | 25 | 25 | 25 | 25 |
Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH
Chargement de la teinture de calcium Fura-2
Nous chargeons les cellules avec acétoxy-méthyl-ester Fura-2 (Fura-2 AM), qui diffuse à travers la membrane cellulaire et est de-estérifiés par des estérases cellulaires pour produire Fura-2 sans acide. Les paramètres exacts pour Fura-2 de chargement varient énormément selon les types de cellules. Nous recommandons de tester diverses conditions en préparant des solutions de chargement de plusieurs contenant une concentration multiple de Fura-2 fait rage 1-4 uM, l'incubation des cellules dans la solution de chargement pour une variété de fois à partir de 15 minutes à 2 heures et le test du chargement à température ambiante et à 37 deg. Un protocole simplifié pour les neurones corticaux est donnée ci-dessous:
- Tout d'abord, préparer le 1 mM Fura-2 heures en ajoutant 50 pl stocks de DMSO dans un flacon 50μg disponibles chez Invitrogen. Il est important d'utiliser le DMSO sec emballé sous azote et il est nécessaire d'éliminer le DMSO avec une aiguille en perforant le septum pour empêcher l'hydratation du DMSO. Après la préparation de la solution Fura-deux heures le conserver dans un endroit sombre et sec. Fura-deux heures dans le DMSO est stable à température ambiante pendant 24 heures et est stable à - 20 degrés dans un récipient sec pendant plusieurs mois.
- Aliquote de 2 ml de milieux de culture dans un tube de 15 ml conique, chaude à 37 degrés. et ajouter des 2μl Fura-2 heures pour produire un stock de 1 uM Fura-2 heures solution. Vortex la solution vigoureusement pendant 1 minute.
- Transférer la solution de chargement pour une boîte de culture tissulaire 35 mm et le transfert de la lamelle avec les cellules dans le plat.
- Incuber les neurones à 37 degrés pendant 30 minutes dans un endroit sombre incubateur. Temps d'incubation de la précision.
- Préparer un plat de 35 mm contenant 2 ml de milieux de culture tissulaire, sans Fura-2 heures. Enlever les lamelles de la solution de chargement et de place dans le nouveau plat.
- Montez la lamelle sur la chambre d'imagerie. Enlever les lamelles de l'antenne de 35 mm et rapidement monter sur la chambre en prenant soin de prévenir l'assèchement des cellules. Nous utilisons une chambre d'imagerie fabriqué par Warner Instruments qui permet une lamelle de 10mm contenant les cellules à être monté sur le fond et une lamelle deuxième à être monté sur le haut formant un sandwich. Les deux lamelles sont sécurisés avec de la graisse à vide à la chambre et deux tubes à chaque extrémité de la chambre de permettre la perfusion de solutions à travers la chambre. La ligne d'entrée est reliée à une seringue et la ligne de sortie est reliée à un puits qui est vidé par une ligne d'aspiration relié à un piège à vide.
Le microscope
Nous utilisons une inversé Nikon Eclipse TE2000-U microscope équipé d'une lampe au xénon à arc (Sutter Instruments), une étape automatisée (Ludl), une roue de filtre d'excitation (Ludl), et une charge de refroidissement couple appareil (CCD) (Hamamatsu Orka II). Le microscope est contrôlé par un com Macintoshordinateur exécutant le logiciel Lab ouvert (Improvisation). Plusieurs autres logiciels sont disponibles pour l'imagerie ratiométrique. Pour l'imagerie que nous utilisons 40, 60 ou 100x Nikon objectifs Fluor immersion dans l'huile avec un NA dépassant pas 1,2.
Imagerie Protocole
- Calibrer la platine du microscope.
- Charge Tyrodes solution dans la ligne d'entrée en prenant soin d'éviter la formation de bulles d'air.
- Connectez la chambre pour les lignes de perfusion et perfuser Tyrodes solution à travers la chambre une fois de plus, en prenant soin d'éviter la formation de bulles dans la chambre
- Déposer une goutte d'huile sur l'objectif, placez la chambre sur la platine du microscope et de se concentrer sur les cellules en utilisant la lumière transmise.
- Examinez la fluorescence des cellules en utilisant un éclairage à 340 et à 380 nm en utilisant les oculaires. Les cellules au repos doivent être sombres et lumineux à 340 à 380. En général, les cellules ne doivent pas être éclairée par une lumière UV pendant plus de 10 ou 15 secondes et l'intensité de la lumière d'excitation doit être réduite avec une densité neutre filtre pour empêcher la phototoxicité.
- Examiner les cellules en utilisant l'appareil et réglez le gain et l'exposition de la caméra pour générer une image qui est proche de la saturation (mais pas saturé) lorsqu'il est éclairé à 380 nm et bien en dessous de la saturation lorsqu'il est éclairé à 340 nm. Gardez l'exposition en dessous de 200ms si possible. Une fois fixé, ne modifiez pas le gain de la caméra ou l'exposition à moins que vous prévoyez aussi modifier l'arrière-plan, Rmin et Rmax (voir ci-dessous).
- Recueillir une image à chaque longueur d'onde et de l'utilisation de la région d'intérêt (ROI) outil pour mesurer l'intensité de l'expérience dans une variété d'endroits dans les images pour chaque longueur d'onde.
- Moyenne des valeurs de fond et entrez les valeurs de fond dans les endroits appropriés dans le programme d'imagerie. La valeur de fond sera soustrait de chaque pixel dans le domaine.
- Recueillir une image ratio de pratiques et d'adapter les valeurs seuils pour chaque longueur d'onde pour générer un rapport d'image qui inclut uniquement les cellules et non le fond et qui n'est pas bruyant dans la région près des bords des cellules.
- Réglez la valeur de ratio minimum (Rmin) à environ 10% en dessous du ratio le plus bas de n'importe quelle cellule dans le domaine.
- Réglez le RMax à environ 12 fois le Rmin. Ne changez pas le rmin ou RMax entre les expériences que vous envisagez de comparer car il fera la comparaison difficile. Nous avons rarement changer le Rmin et les valeurs Rmax sur notre banc d'imagerie.
- Utilisez la scène automatisé de trouver les champs que vous prévoyez d'image et enregistrer l'emplacement de chaque champ en utilisant le logiciel. En général, nous recueillons cinq champs de vue lors d'une expérience. Le stade de mouvements automatiques à un champ, recueille un rapport d'image et se déplace sur le champ suivant.
- Régler l'intervalle de temps-faute pour recueillir des images entre 0,1 et 10 secondes d'intervalle, selon le type de signaux que vous vous attendez à voir.
- Démarrer l'expérience.
- Lors du test du système d'imagerie du calcium, il est souvent utile d'utiliser des stimuli tels que Tyrodes élevé en potassium (65 mM de KCl) ou ionomycine (2 pm) qui va provoquer une élévation du calcium intracellulaire et extracellulaire de calcium solution gratuite qui va (contenant les tampons de calcium, comme l'EGTA et BAPTA ) qui permettra de réduire la concentration de calcium.
Analyse
Une fois l'expérience terminée, vous voulez convertir l'ensemble des images dans le rapport de mesures du calcium time-lapse pour des cellules individuelles ou des régions d'intérêt dans les cellules. Pour ce faire:
- Utilisez la région de l'outil d'intérêt (ROI) pour définir les zones de l'image dans laquelle vous voulez mesurer le calcium. Il est généralement utile d'avoir au moins un retour sur investissement qui couvre le corps cellulaire de la cellule. Lors de la définition du ROI, il est utile de lire le film sur les images pour vérifier que les cellules ne se déplacent pas pendant le cours de l'expérience.
- Utilisez le logiciel pour collecter des mesures de rapport time-lapse pour chaque ROI de chaque image.
- Importer les mesures du rapport dans un programme d'analyse. Vous aurez besoin de voir les traces de calcium pour des cellules spécifiques ou ROIs, moyenne ou plusieurs cellules ROIs et convertir les mesures du rapport à la valeur intracellulaire de calcium. Nous utilisons un ensemble de macros écrites en Pro Igor qui nous permettent de faire toutes ces tâches d'analyse commune, mais d'autres programmes comme Excel, bien que moins pratique peut également être utilisé.
- L'équation [Ca] = (RR min) / (R max-R) Sf * Kd peut être utilisé pour convertir les valeurs du rapport Fura-2 pour les concentrations intracellulaires de calcium. [Ca] est la concentration de calcium, R est le Fura-2 340/380 ratio, Rmin et Rmax sont les ratios 340/380 en l'absence de calcium ou en présence d'une concentration saturante de calcium, respectivement, et Sf * Kd est le produit de la Kd de Fura-2 (environ 120 nm à température ambiante) et une valeur d'échelle. Pour mesurer R Min, Max et R * Sf Kd, il est nécessaire d'effectuer soit un in vivo ou in vitro une dans l'étalonnage. Lors de la calibration in vivo requiert unecombinaison de patch clamp et d'imagerie calcique, qui peut être compliqué, mais est également très précis. Lors de la calibration in vitro peut être fait en utilisant un home-made chambre de calibration qui se compose de deux lamelles séparées par une entretoise fine lamelle de générer une fine couche de solution dans laquelle effectuer l'étalonnage. Le moyen le plus commode de mesurer des valeurs Fura-2 rapport en fonction des concentrations de calcium est d'utiliser un kit de calibration qui contiennent plusieurs solutions de calcium tamponné et Fura-2 sans acide. Ceux-ci peuvent être obtenus auprès de Invitrogen (Molecular Probes) et contiennent des instructions précises pour l'utilisation.
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Discussion
Dans cette présentation, nous avons franchi toutes les étapes pour effectuer l'imagerie calcique utilisant Fura-2 heures. Nous avons utilisé les neurones corticaux comme un modèle, mais l'imagerie calcique peuvent être utilisés pour mesurer le calcium intracellulaire en temps réel dans une variété de cellules. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important d'utiliser des lamelles en verre au lieu du plastique, le plastique est souvent fluorescentes à des longueurs d'onde ultraviolettes, ce qui rend l'imagerie difficile. En outre, il est important de pré-couche avec les lamelles polyornithine et la laminine dans le but d'empêcher les cellules de se détacher. Enfin, il est important de se rappeler pour éviter de créer des bulles d'air lors de perfusion de solutions à travers la chambre de l'imagerie.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | Electron Microscopy Sciences | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes, Life Technologies | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
