Summary
الصورة التي يسببها عبر ربط بروتينات معدلة (PICUP) يسمح توصيف توزيع حجم قليل وحدات البروتين في الخلائط متبدل الاستقرار. علينا أن نظهر لتطبيق PICUP الببتيدات التمثيل الثلاثة amyloidogenic 40 -- 42 وبقايا أشكال اميلويد β البروتين ، والكالسيتونين ، والتحكم الببتيد هرمون النمو الافراج عن عامل.
Abstract
تجميع البروتينات amyloidogenic في oligomers السامة هي الحدث البارز في التسبب في أمراض misfolding البروتين ، بما في ذلك مرض الزهايمر ، وباركنسون وأمراض هنتنغتون ، وراثي التصلب الجانبي ، وداء السكري من النوع 2. نظرا لطبيعة هذه التجمعات متبدل الاستقرار البروتين ، فمن الصعب تقدير حجم قليل وحدات توزيعها كميا باستخدام الطرق التقليدية ، مثل الكهربائي ، وتشتت الضوء اللوني ، مضان ، أو حيوية. Oligomers من البروتينات موجودة في الخلائط amyloidogenic متبدل الاستقرار ، الذي فصل في oligomers مونومرات والمنتسبين إلى أكبر التجمعات في نفس الوقت. PICUP استقرار السكان قليل وحدات من خلال لقطات عبر ربط وعند دمجها مع أساليب التجزئة ، مثل الكهربائي سلفات الصوديوم دوديسيل هلام بولي أكريلاميد (SDS - PAGE) أو الحجم الاستبعاد اللوني (SEC) ، ويوفر PICUP التساهمية من حجم التوزيعات التي كانت موجودة قبل قليل وحدات الصليب ربط. وبالتالي ، يمكن تصور PICUP والتحليل الكمي للسكان البروتين متبدل الاستقرار ، ويمكن استخدامها لمراقبة فك التجمع والعلاقات بين التعديلات وتسلسل oligomerization
Protocol
1. إعداد الببتيد
- ~ خارج تزن 100-200 ميكروغرام من الببتيد مجفد باستخدام microbalance ونقل الى المسمى ، المغلفة السيليكون ، وأنابيب الممتزات microfuge المنخفضة. هنا ، فإننا نستخدم تسلسل الإنسان من Aβ40 ، Aβ42 ، الكالسيتونين ، وGRF.
- هنا ، فإننا نستخدم الببتيد قبل تعامل مع بروبانول 1،1،1،3،3،3 - hexafluoro - 2 (HFIP) للحصول على واحدة متجانسة ، خالية من مجموع الاستعدادات. هذه الخطوة كانت ضرورية لأن ما قبل تشكيل المجاميع حمل التجميع السريع للبروتينات amyloidogenic ، مما يؤدي إلى استنساخ التجارب بين الفقراء 5. أساليب أخرى مثل الترشيح والمجلس الأعلى للتعليم يمكن أن تستخدم أيضا للحصول على مجموع خالية من الاستعدادات لPICUP 6.
- لعلاج الببتيدات مع HFIP ، قبل البرد الحاوية على الجليد HFIP داخل غطاء الدخان ترتدي الحماية الكافية (HFIP متقلبة والسامة). تبريد زجاجة 250 مل يتطلب عادة 10-15 دقيقة. إضافة إلى ما قبل HFIP المبردة التي تحتوي على أنابيب lyophilizates الببتيد للحصول على تركيز الببتيد اسمية قدرها 0.5 ملم.
- يصوتن الحلول الببتيد في sonicator مياه الاستحمام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- دوامة بلطف واحتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- البرد الأنابيب على الجليد (على 1 دقيقة) ، وتقسيم الحلول في 10 - 50 - ميكرولتر aliquots في المسمى أنابيب الممتزات منخفضة 0.6 مل.
- إزالة HFIP عن طريق التبخر في ظل تيار لطيف من النيتروجين ، أو ترك أنابيب مفتوحة في غطاء الدخان بين عشية وضحاها. للتبخر بين عشية وضحاها ، وضع أنابيب فتح في رفوف وغطاء لهم مع ورقة كبيرة من Kimwipes لمنع الغبار وتلوث الجسيمات.
- يجفف في HFIP المتبقية في الخلاء في lyophilizer ، أو المكثف الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة ، أو في exsiccator تعلق على مدخل فراغ لح 2 وسوف يكون المنتج النهائي فيلم الببتيد في الجزء السفلي من أنابيب microfuge. إذا مجفف بشكل صحيح ، يمكن تخزين أنابيب محكمة الإغلاق لفترات طويلة (أشهر) في -20 أو -80 درجة مئوية.
2. Solubilizing الببتيد HFIP المعاملة والصورة عبر ربط -
- قبل solubilizing الببتيد HFIP معاملة لردود الفعل ، عبر ربط ، واحد يحتاج إلى إعداد عبر ربط والكواشف التبريد.
- تزن خارج بيرسلفات الأمونيوم (الجزائرية ، السيد 228.2 غرام / مول) ، ويعد حل 20 ملي في 10 ملي فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.4. مزيج باستخدام الدوامة حتى حل واضح.
- إعداد 1 ملم من حل تريس (2،2 - bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrate (RuBpy السيد 748.63 غ / مول) في 10 ملي فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.4. مزيج باستخدام الدوامة والتحقق من حل كامل. حماية أنبوب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
- لSDS - PAGE التحليل التالي عبر ربط ، وكاشف تبريد مريحة هو 5 ٪ β - المركابتويثانول في 2 × SDS - PAGE العازلة العينة. بدلا من ذلك ، 1 م dithiothreitol (DTT ، السيد 154.5 غرام / مول) يمكن استخدامها في الماء منزوع الأيونات أو عازلة مناسبة.
- تذاب الأفلام الببتيد HFIP المعاملة في أول هيدروكسيد الصوديوم المخفف ثم يضاف الصوديوم الفوسفات عازلة للحصول على 30 ميكرومتر ~ الببتيد التركيز. ثم إضافة 60 ملم من الماء منزوع الأيونات هيدروكسيد الصوديوم في أنبوب يحتوي على فيلم الببتيد مثل هيدروكسيد الصوديوم والمياه التي تشكل 10 و 45 ٪ من الحجم النهائي ، على التوالي. كشط الفيلم الببتيد قبالة الجدران الداخلية للأنبوب microfuge به الطرف ، عن طريق مزيج pipetting صعودا وهبوطا ، ويصوتن لمدة 5 دقائق في حمام ماء sonicator.
- إضافة 45 ٪ فوسفات الصوديوم 20 ملم ، ودرجة الحموضة 7.4 ، من خلال مزيج pipetting ، والطرد المركزي في 16000 ز لمدة 10 دقيقة. جانبا من غير متقاطع aliquots المرتبطة الببتيدات مختلطة مع كاشف التبريد لعناصر سلبية.
- ضبط الكاميرا مصراع تأخير إلى 1 ثانية. في بعض الأحيان أعلى التشعيع ، قد يسبب ردود فعل متطرفة واسعة تدهور البروتين. تحميل مصراع الكاميرا. قد تحتاج إلى وقت تشعيع يكون الأمثل عند استخدام الأسلوب مع البروتين الجديد.
- يتم تنفيذ رد فعل PICUP نموذجية في حجم رد فعل 20 ميكرولتر. نقل 18 ميكروليتر من الحل الببتيد في أنبوب رقيقة الجدران ، واضحة ، PCR - 0.2 مل.
- إلى الحل الببتيد ، إضافة 1 RuBpy ميكرولتر تليها وكالة الأنباء الجزائرية 1 ميكرولتر ومزج الكواشف التي pipetting (تركيز النهائي من وكالة الأنباء الجزائرية RuBpy في خليط التفاعل سيتم 0.05 و 1 ملم ، على التوالي).
- المكان بسرعة رد الفعل داخل أنبوب قارورة زجاجية 1.8 مل. مكان داخل القارورة الكير يعلق امام الكاميرا من الجسم. نعلق حامي العدسة واضغط على مصراع الكاميرا بحيث يتم المشع العينة لمدة 1 ق داخل الكير.
- بعد التشعيع العينة ، بسرعة اتخاذ القارورة من الخوار وأنبوب PCR من القارورة. يشفي بسرعة رد الفعل وذلك بإضافة 1 DTT ميكرولتر أو 10 ميكرولتر عينة PAGE العازلة الحد. كرر رد الفعل لكل قسامة الببتيد.
- ويمكن الآن للمخاليط الرد سيكون في المجمدة -20 درجة مئوية لمدة التخزين لمدة لا تزيد مدة 7 أيام أو أبقى على الجليد قبل التحليل SDS - PAGE والفضة تلطيخ.
3. SDS - PAGE وقطعة من الجبن ، تلطيخالمنتجات الببتيد عبر ربط
- يتم إجراء روتيني SDS - PAGE والفضة إلى تلطيخ تصور عبر ربط الببتيدات.
- تحميل 5 ميكرولتر من خليط التفاعل في الحصول على ممر ~ 130 بمول من الببتيد في الممر.
- وتشمل كميات مماثلة من غير متقاطع المرتبطة الببتيدات للمقارنة. كما تتضمن سلما البروتين القياسية لتقريب بصرية من الوزن الجزيئي للنطاقات الببتيد.
- تشغيل الجل باستخدام جهاز الفصل الكهربائي للهلام القياسية. نستخدم SureLock XCell مصغرة خلية النظام من Invitrogen وأداء الفضة وفقا لتلطيخ Invitrogen نشر IM - 1002 ، Novex الكهربائي جل ما قبل الصب الدليل.
الجزء 4 : النتائج الممثل (الشكل 1)
الشكل 1 : المواد الهلامية بولي أكريلاميد فضة الملطخة تظهر غير متقاطع مرتبطة (--) والصور عبر ربط بين (+) GRF ، الكالسيتونين ، Aβ40 وAβ42
SDS - PAGE والفضة تلطيخ تحليلات PICUP المولدة oligomers Aβ40 تظهر شدة الفرقة مماثلة تقريبا من خلال مونومر tetramer ، يليه انخفاض حاد في وفرة العالي oligomers 7. غير متقاطع مرتبطة Aβ40 يهاجر مع السيد يتفق مع مونومر 7. Aβ42 يظهر حجم قليل وحدات متميزة التوزيع. Aβ42 oligomers تضم 8 مجموعات 2-3. المجموعة الأولى ، من خلال مونومر ترايمر ، يعرض خفض كثافة مع النظام قليل وحدات متزايدة. في المجموعة الثانية ، لوحظ توزيع جاوس الشبيهة بين tetramer وheptamer ، مع كحد أقصى في مخموس ومسدوس. المجموعة الثالثة ، وهي ليست معروضة هنا ، ويحتوي على oligomers دا السيد 30،000-60،000 ~ 8. أعلى هذه oligomers السيد ويلاحظ عادة باستخدام SEC - معزولة LMW Aβ42 لكن ليس الببتيد الترشيح التي أعدتها أو المعاملة HFIP 6. غير متقاطع مرتبطة Aβ42 تنتج في الغالب شريطين ، فرقة مونومر واسعة ترايمر / tetramer الفرقة ، والذي هو الحرفية التي تحدثها SDS 5،9. كالسيتونين غلة توزيع حجم قليل وحدات أن يحيد بقوة من نقصان الأسي رتابة في المنطقة من خلال مونومر tetramer ، مما يشير إلى ما قبل وجود dimers ، trimers وtetramers 7. التحكم ببتيد ، GRF ، وتنتج توزيع رتيب قليل وحدات تتراوح بين ثنائيات من خلال مسدوس مثل هذه المبالغ واضحة الانخفاض النسبي للoligomers باطراد مع زيادة الكتلة الجزيئية. في تجارب أخرى ، وارتفاع oligomers يمكن أيضا تصور 7. قد يكون عدد الدقيق وكثافة نسبية للعصابات قليل وحدات تختلف نوعا ما بين التجارب اعتمادا على تركيز البروتين الفعلية ، وكمية البروتين تحميلها على هلام ، والوقت المستخدم للخطوة التنمية في البروتوكول الفضة تلطيخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وضعت أصلا لدراسة PICUP مجمعات البروتين مستقرة 2. تم تطبيق الطريقة في وقت لاحق لدراسة كمية بروتين اميلويد متبدل الاستقرار الجمعيات ، بما في ذلك Aβ 10 ، بريون والمرض المرتبط بي ار بي بكالوريوس 11 و 12 α - synuclein. أهم العوامل التي يجب أخذها في الاعتبار عند تصميم التجربة PICUP هي رياضيات الكيمياء الكاشف ، تشعيع الوقت ، وعينة تحضير العملية. قد يتطلب مسألتين السابق التحسين التجريبية ، في حين أن القضية الأخيرة يؤثر الى حد كبير تفسير البيانات التجريبية. للبروتينات amyloidogenic على وجه الخصوص ، تحديد حجم التوزيعات oligomers متبدل الاستقرار يتطلب استخدام التجميعية خالية الاستعدادات انطلاق. الخلفية ، والآلية ، وتمت تغطية الأجهزة ، والبروتوكول ، والتحسين ، ونطاقها ، والتعديلات ، والتطبيقات ، وقيود PICUP في المنشورات السابقة 1،2،13. يمكن استخدامها لتوليد PICUP مستقرة ، والبروتين oligomers القابلة للذوبان التي تجزيء التالية والتنقية ، ويمكن استخدامها في الدراسات البنيوية ، المقايسات السمسة والدراسات oligomerization تثبيط ، والأهداف من أجل التنمية والتعرف على الأدوات الجزيئية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق المنح وAG027818 AG030709 من المعاهد الوطنية للصحة / NIA ، 2005/2E من مؤسسة لاري Hillblom L. ، IIRG - 07-58334 من جمعية الزهايمر ، و07-65798 من قسم الصحة العامة في ولاية كاليفورنيا.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp d–s not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chase | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).
- Kluger, R., Alagic, A. Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols. Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).
- Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes. Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays. Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).
- Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands. Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies). Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).
- Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions. Amyloid. 13, 67-77 (2006).
- Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking. Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).
- Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking. Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).
