Summary
Foto-induzida ligação cruzada de proteínas não modificadas (picup) permite a caracterização da distribuição de tamanho de oligômero em misturas de proteínas metaestável. Demonstramos aplicação de picup a três peptídeos representante amiloidogênicas a 40 - e 42 resíduos de formas de amilóide β-proteína, e calcitonina, peptídeo e um controle do fator de crescimento hormônio liberador.
Abstract
O conjunto de proteínas amiloidogênicas em oligômeros tóxicos é um evento seminal na patogênese de doenças proteína misfolding, incluindo Alzheimer, Parkinson e doenças de Huntington, esclerose amiotrófica hereditária lateral, e diabetes tipo 2. Devido à natureza metaestável destes conjuntos de proteínas, é difícil avaliar a sua distribuição de tamanho de oligômero quantitativamente usando métodos clássicos, tais como eletroforese, cromatografia de espalhamento de luz, fluorescência, ou dinâmico. Oligômeros de proteínas amiloidogênicas existir como misturas metaestável, em que os oligômeros se dissociam em monômeros e associar em conjuntos maiores simultaneamente. Picup estabiliza populações oligômero por covalente cross-linking e quando combinado com métodos de fracionamento, como eletroforese em gel de sulfato de sódio dodecil de poliacrilamida (SDS-PAGE) ou tamanho-exclusão cromatografia (SEC), picup fornece instantâneos das distribuições de tamanho de oligômero que existia antes de cruz -linking. Assim, picup permite a visualização e análise quantitativa das populações de proteína metaestável e pode ser usado para monitorar a montagem e decifrar as relações entre modificações seqüência e oligomerização
Protocol
1. Preparação de peptídeos
- Pesar ~ 100-200 mg de peptídeo liofilizado usando uma microbalança e transferência para rotulados, revestido a silicone, tubos de microcentrífuga de baixa adsorvente. Aqui, nós usamos seqüências de humanos de Aβ40, Aβ42, calcitonina e GRF.
- Aqui, usamos peptídeos pré-tratados com 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para obter homogênea, agregar-free preparativos. Esta etapa é necessária porque pré-formados agregados induzir a agregação rápida de proteínas amiloidogênicas, que resultam em reprodutibilidade pobres entre os experimentos 5. Outros métodos, como a filtração ea SEC também pode ser usado para obter agregados sem preparativos para picup 6.
- Para tratar os peptídeos com HFIP, pré-resfriar o recipiente com gelo dentro HFIP um exaustor usando proteção adequada (HFIP é volátil e tóxico). Resfriamento de uma garrafa de 250 ml normalmente exige 10-15 min. Adicionar HFIP de pré-refrigerados contendo tubos lyophilizates peptídeo para obter uma concentração de peptídeo nominal de 0,5 mM.
- Sonicate as soluções em um peptídeo sonicador banho-maria por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Vortex suavemente e incubar os tubos durante 30 min à temperatura ambiente.
- Relaxar os tubos no gelo (para 1 min), e dividir as soluções em 10-50-mL em alíquotas de 0,6 ml rotulados de baixa adsorvente tubos.
- Remover HFIP por evaporação sob uma ligeira corrente de nitrogênio, ou deixar os tubos abertos na capela durante a noite. Para a evaporação durante a noite, coloque os tubos abertos em um rack e cobri-los com uma grande folha de Kimwipes para evitar poeira e contaminação por partículas.
- Enxugar o HFIP restantes no vácuo em um liofilizador, ou um concentrador de centrífuga por 30 min, ou em um exsiccator ligado a uma entrada de vácuo por 2 h. O produto final será um filme peptídeo na parte inferior dos tubos de microcentrífuga. Se devidamente ressecada, os tubos podem ser armazenados por longos períodos hermético (meses) a -20 ou -80 ° C.
2. Solubilizar os peptídeos HFIP-tratados e foto cross-linking
- Antes de solubilizar os peptídeos HFIP-tratado para cross-linking reações, é preciso preparar o cross-linking e reagentes de extinção.
- Pesar persulfato de amônio (APS, o Sr. 228,2 g / mol) e preparar uma solução de 20 mm em 10 mM fosfato de sódio, pH 7.4. Misture usando um vortex até que a solução é clara.
- Prepare uma solução mM de Tris (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium hexa (II) (RuBpy, deputado 748,63 g / mol) em 10 mM fosfato de sódio, pH 7.4. Misture usando um vortex e verificar a completa dissolução. Proteger o tubo de luz usando uma folha de alumínio.
- Para SDS-PAGE após análise cross-linking, um reagente quenching conveniente é de 5% β-mercaptoetanol em 2 × SDS-PAGE tampão de amostra. Alternativamente, um M ditiotreitol (DTT, o Sr. 154,5 g / mol) em água deionizada ou um tampão adequado pode ser usado.
- Filmes HFIP tratados com peptídeo são dissolvidos em NaOH diluída primeiro e depois tampão fosfato de sódio é adicionado para obter concentração de peptídeo ~ 30 mM. Adicionar 60 mM NaOH seguido de água deionizada no tubo contendo o filme de tal forma que peptídeo NaOH e água constituem 10 e 45% do volume final, respectivamente. Raspe o filme peptídeo fora das paredes dentro do tubo de microcentrífuga, utilizando a ponta, misture pipetando cima e para baixo, e sonicate por 5 minutos em um sonicador banho-maria.
- Adicionar 45% de fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, mix de pipetagem, e centrifugar a 16.000 g por 10 min. Separe alíquotas de descruzar-linked peptídeos misturado com o reagente de têmpera para controles negativos.
- Ajustar a câmera do obturador demora a 1 s. Às vezes maior irradiação, extensas reações radicais podem causar degradação de proteínas. Carregar o obturador da câmera. Tempo de irradiação pode precisar de ser otimizado quando se utiliza o método com uma nova proteína.
- Uma reação típica é picup realizada em um volume de reação 20 l. Transferência de 18 mL da solução de peptídeo em uma parede fina, clara, tubo de PCR de 0,2 ml.
- Para a solução de peptídeo, adicione 1 mL RuBpy seguido por uma APS mL e misturar os reagentes por pipetagem (a concentração final de RuBpy APS e na mistura de reação será 0,05 e 1 mM, respectivamente).
- Colocar rapidamente o tubo de reação dentro de um frasco de vidro de 1,8 mL. Coloque o frasco dentro do fole anexado na frente do corpo da câmera. Anexar o protetor de lente e pressione o botão do obturador para que a amostra é irradiada por 1 s no interior do fole.
- Após a irradiação da amostra, assumir rapidamente o frasco fora do fole e do tubo de PCR fora do frasco. Rapidamente saciar a reação pela adição de um TDT mL ou 10 mL tampão de amostra reduzindo PAGE. Repita a reação para cada alíquota peptídeo.
- As misturas de reação pode agora ser congeladas a -20 ° C para o armazenamento por um período de 7 dias ou mantidos em gelo antes da análise por SDS-PAGE e coloração de prata.
3. SDS-PAGE e tira-manchasde produtos cross-linked peptídeo
- Rotina SDS-PAGE e coloração prata-são realizadas para visualizar cruzada peptídeos.
- Carga de 5 mL da mistura de reação por pista para obter ~ 130 pmol de peptídeo por pista.
- Incluem quantidades similares de descruzar-linked peptídeos para comparação. Também incluem uma escada de proteína padrão de aproximação visual de bandas de peso molecular de peptídeos.
- Executar o gel utilizando um aparelho de eletroforese em gel padrão. Nós usamos o sistema de XCell SureLock Mini-Cell da Invitrogen e realizar a coloração de prata de acordo com a publicação Invitrogen IM-1002, Novex Pre-Cast Guia de eletroforese em gel.
Parte 4: Resultados Representante (Figura 1)
Figura 1: géis de poliacrilamida mostrando uncross-linked (-) e foto-cross-linked (+) GRF, calcitonina, Aβ40 e Aβ42
SDS-PAGE e coloração prata-análises de picup gerado Aβ40 oligômeros mostram intensidades banda aproximadamente igual de monômero através tetrâmero, seguido por uma acentuada diminuição na abundância de oligômeros maior 7. Descruze-linked Aβ40 migra com um deputado consistente com a de monômero 7. Aβ42 mostra uma distribuição de tamanho distintas oligômero. Aβ42 compreendem oligômeros 2-3 grupos de 8. O primeiro grupo, através de monômero trímero, exibe a diminuir de intensidade com a ordem crescente de oligômero. No segundo grupo, a distribuição de Gauss-como é observada entre tetrâmero e heptamer, com um máximo em pentâmero e hexâmero. O terceiro grupo, que não é mostrado aqui, contém oligômeros do Sr. ~ 30,000-60,000 Da 8. Estes oligômeros maior Mr normalmente são observados usando SEC isolada LMW Aβ42 mas não peptídeo preparada por filtração ou tratamento HFIP 6. Descruze-linked Aβ42 produz predominantemente duas bandas, uma banda de monômero e uma banda trímero / tetrâmero amplo, que é um artefato induzida por SDS 5,9. Calcitonina produz uma distribuição de tamanho de oligômero que diverge fortemente de uma diminuição monótono exponencial do monômero região através tetrâmero, sugerindo pré-existência de dímeros, trímeros, tetrâmeros e 7. O controle de polipeptídeo, GRF, produz uma distribuição de oligômero monotônica desde dímeros através de hexâmero de tal forma que os montantes aparente relativa de oligômeros diminuir exponencialmente com o aumento da massa molecular. Em outros experimentos, oligômeros mais altas também poderiam ser visualizadas 7. O número exato e intensidades relativas das bandas de oligômero pode variar um pouco entre os experimentos, dependendo da concentração de proteína real, a quantidade de proteína carregado no gel, eo tempo utilizado para a etapa de desenvolvimento no protocolo de coloração prateada.
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Discussion
Picup foi desenvolvido originalmente para estudar complexos de proteína estável 2. O método foi aplicado mais tarde para estudo quantitativo de assembléias amilóide metaestável proteína, incluindo Aâ 10, prion e doenças associadas ao PrP Sc 11, e α-sinucleína 12. Os fatores mais importantes que devem ser considerados ao projetar um experimento picup estão a estequiometria reagente, tempo de irradiação, eo procedimento de preparação da amostra. As duas primeiras questões podem exigir otimização empírica, enquanto que a última questão em grande parte afeta a interpretação dos dados experimentais. Para proteínas amiloidogênicas em particular, a determinação de distribuições de tamanho de oligômeros metaestável requer o uso de agregado sem preparativos de partida. O pano de fundo, o mecanismo, instrumentação, protocolo, otimização, escopo, modificações, aplicações e limitações do picup foram cobertos em publicações anteriores 1,2,13. Picup pode ser usado para gerar estável, oligômeros proteína solúvel que seguir fracionamento e purificação, poderiam ser usados para estudos estruturais, ensaios de citotoxicidade, oligomerização inibição de estudos, e como alvos para o desenvolvimento de reconhecimento molecular ferramentas.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações e AG027818 AG030709 de NIH / NIA, 2005/2E da L. Larry Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 da Associação Alzheimer, e 07-65798 da Califórnia Departamento de Saúde Pública.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp d–s not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chase | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
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