Summary
Фотоиндуцированные сшивания немодифицированных белков (PICUP) позволяет характеристика олигомер распределение по размерам в метастабильных смесей белков. Мы демонстрируем применение PICUP-три представителя амилоидогенный пептиды, 40 - и 42-остаток форм амилоидных β-белок, и кальцитонин, а также контроль пептидных гормонов роста-рилизинг-фактора.
Abstract
Сборка амилоидогенный белков в токсических олигомеров является знаковым событием в патогенезе неправильного фолдинга белков заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, Паркинсона, болезни Гентингтона, наследственный боковой амиотрофический склероз и сахарный диабет 2 типа. Благодаря метастабильных природу этих белков сборки, трудно оценить их распределение по размерам олигомер количественно с использованием классических методов, таких как электрофорез, хроматография, флуоресценция, или динамического рассеяния света. Олигомеров амилоидогенный белки существуют в виде метастабильных смесей, в которых олигомеров распадаются на мономеры и объединяться в большие сборки одновременно. PICUP стабилизирует олигомер населения путем ковалентного сшивания и в сочетании с фракционирования методы, такие как додецилсульфата натрия полиакриламидном геле (SDS-PAGE) или гель-хроматографии (SEC), PICUP предоставляет снимки распределения олигомеров размера, который существовал до креста сшивания. Таким образом, PICUP позволяет визуализации и количественного анализа метастабильных популяции белок и может быть использован для контроля сборки и расшифровать отношения между последовательностью изменений и олигомеризации
Protocol
1. Пептид подготовки
- Отвешивать ~ 100-200 мкг лиофилизированного пептида использованием микровесов и передачи в подписанные, кремния, покрытые оболочкой, низким адсорбента труб отцентрифугировать. Здесь мы используем человеческие последовательности Aβ40, Aβ42, кальцитонин, и GRF.
- Здесь мы используем пептиды предварительно обработанных 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол (HFIP), чтобы получить однородную, совокупный без препаратов. Этот шаг необходим, потому что предварительно сформированных агрегатов вызывают быстрое агрегации амилоидогенный белков, что приводит к плохой воспроизводимости эксперимента у 5. Другие методы, такие как фильтрация и SEC также может быть использован для получения совокупного без подготовки PICUP 6.
- Для лечения пептидов с HFIP, предварительно охладить HFIP контейнере со льдом внутри вытяжного шкафа носить адекватную защиту (HFIP изменчив и токсичных). Охлаждение 250 мл бутылке обычно требуется 10-15 мин. Добавить HFIP предварительно охлажденные пробирки, содержащие пептидные лиофилизатов для получения номинальной концентрации пептида 0,5 мм.
- Разрушать ультразвуком пептид решения в водяной бане sonicator в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Vortex мягко и инкубировать пробирки в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Холод труб на льду (в течение 1 мин), и разделить решения на 10-50-мкл аликвоты в маркированных 0,6-мл низким адсорбента труб.
- Удалить HFIP выпариванием под струю азота, или оставить открытой трубы в вытяжном шкафу в течение ночи. За ночь испарения, место открытое труб в стойке и покрывают их большой лист Kimwipes чтобы предотвратить попадание пыли и твердых частиц загрязнений.
- Высушивать оставшиеся HFIP в вакууме в лиофилизатор или центробежного концентратора в течение 30 мин, или в эксикаторе прилагается к вакуумным входе в течение 2 ч. Конечный продукт будет пептид фильма в нижней части микроцентрифужную труб. Если правильно высушенный, трубы могут быть сохранены герметичном в течение длительного периода (месяца) при -20 или -80 ° C.
2. Солюбилизирующие HFIP обработанных пептидов и фото сшивания
- Перед солюбилизирующие HFIP обработанных пептидов для сшивания реакций, необходимо подготовить сшивания и тушения реагентов.
- Отвешивать персульфата аммония (APS, г-н 228,2 г / моль) и подготовить 20 мМ раствора в 10 мМ фосфат натрия, рН 7,4. Смешайте использованием вихревой пока раствор не станет прозрачным.
- Подготовка 1 мМ раствора Трис (2,2-бипиридил) dichlororuthenium (II) гексагидрат (RuBpy, г-н 748,63 г / моль) в 10 мМ фосфат натрия, рН 7,4. Смешайте использованием вихря и проверить полного растворения. Защита труб от света с помощью алюминиевой фольги.
- Для SDS-PAGE анализа следующих сшивания, удобный реагент закалки составляет 5%, β-меркаптоэтанол в 2 × SDS-PAGE образца буфера. Кроме того, 1 М дитиотреитол (DTT, г-н 154,5 г / моль) в деионизированной воды или подходящего буфера могут быть использованы.
- HFIP обработанных фильмов пептидные растворяют в разбавленной NaOH, а затем буфера фосфата натрия добавляется, чтобы получить ~ 30 мкМ пептида концентрации. Добавить 60 мМ NaOH затем деионизированной воды в пробирку, содержащую пептид фильм так, что NaOH и воды составляют 10 и 45% от конечного объема, соответственно. Очистите пептид фильм от внутренних стен микроцентрифужную трубки с помощью иглы, перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, и разрушать ультразвуком в течение 5 мин в водяной бане sonicator.
- Добавить 45% 20 мМ фосфат натрия, рН 7,4, перемешать с помощью пипетки и центрифуги при 16000 г в течение 10 мин. Отложите аликвоты распрямить связанные пептиды, смешивается с тушением реагент для отрицательного контроля.
- Настройка камеры затвора задержка 1 с При более высоких раз облучения, обширные радикальные реакции могут привести к деградации белка. Нагрузка затвора камеры. Облучение время, возможно, должны быть оптимизированы при использовании метода с нового белка.
- Типичная реакция PICUP выполняется в объеме 20 мкл реакции. Передача 18 мкл пептида раствора в тонкостенные, ясно, 0,2 мл ПЦР-пробирку.
- Для решения пептид, добавить 1 мкл RuBpy затем по 1 мкл APS и смешать реактивы с помощью пипетки (конечная концентрация RuBpy и APS в реакционной смеси будет 0,05 и 1 мМ, соответственно).
- Быстро место реакционную трубку внутри 1,8-мл стеклянный флакон. Место флакона внутри сильфона прилагается в передней части корпуса камеры. Прикрепить защиты объектива и нажмите кнопку спуска затвора, так что образец облучается в течение 1 с внутри сильфона.
- После облучения образца, быстро принимать флакон из мехов и ПЦР-пробирку из флакона. Быстро погасить реакцию добавлением 1 мкл DTT или 10 мкл буфера снижения СТРАНИЦА образца. Повторите реакции для каждого пептида аликвоту.
- Реакционной смеси может теперь быть заморожены при температуре -20 ° C для хранения на срок не более 7 дней или держится на льду перед анализом на SDS-PAGE и серебристо-окрашивания.
3. SDS-PAGE и ленты-окрашиваниесшитого продукты пептида
- Рутинное SDS-PAGE и серебристо-окрашивание выполняется для визуализации сшитых пептидов.
- Нагрузка 5 мкл реакционной смеси на одну полосу движения для получения ~ 130 пмоль пептида на одну полосу движения.
- Включите одинаковое количество распрямить связанных пептидов для сравнения. Кроме того, включать стандартные лестницы белка для визуального приближения молекулярного веса пептидных групп.
- Выполнить гель с использованием стандартного аппарата гель-электрофореза. Мы используем XCell SureLock Мини-Cell системы от Invitrogen и выполнять серебристо-окрашивания в соответствии с Invitrogen публикации IM-1002, Novex сборных гель-электрофореза руководства.
Часть 4: Представитель результаты (рис. 1)
Рисунок 1: Серебряный окрашенных полиакриламидном геле показывает распрямить связанных (-) и фото-сшитого (+) GRF, кальцитонин, Aβ40 и Aβ42
SDS-PAGE и серебристо-окрашивание анализ PICUP генерируемых Aβ40 олигомеров показывают примерно одинаковые интенсивности полос мономера через тетрамер, после резкого снижения в изобилии высших олигомеров 7. Распрямить связанных Aβ40 мигрирует с г-н соответствуют тем, которые мономера 7. Aβ42 показывает четкое распределение размеров олигомера. Aβ42 олигомеров составляют 2-3 групп 8. Первая группа, мономера через тример, показывает уменьшение интенсивности с увеличением олигомер порядке. Во второй группе, гауссовой, как распределение наблюдается между тетрамера и гептамера, с максимумом в пентамера и гексамера. Третья группа, которая здесь не показана, содержит олигомеры г ~ 30,000-60,000 Da 8. Эти более высокие господин олигомеров как правило, наблюдались с помощью SEC-изолированных LMW Aβ42 но не пептида подготовленный фильтрации или HFIP лечения 6. Распрямить связанных Aβ42 производит преимущественно две группы, группы мономера и тримера широким / тетрамер группа, которая является артефактом индуцированных SDS 5,9. Кальцитонин дает распределение олигомеров размеров, что сильно расходится с монотонным экспоненциальное падение в регионе мономера через тетрамер, предполагая, предсуществовании димеров, тримеров и тетрамеров 7. Контроль полипептид, GRF, производит монотонный распределение олигомеров от димера через гексамера, что очевидно относительное количество олигомеров убывают экспоненциально с увеличением молекулярной массы. В других экспериментах, высшее олигомеров также могут быть визуализированы 7. Точное количество и относительные интенсивности полос олигомер могут несколько отличаться среди экспериментов в зависимости от фактической концентрации белка, количество белка, погруженных на гель, а время, затрачиваемое на развитие шаг в серебристо-окрашивание протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PICUP была разработана первоначально для изучения устойчивые комплексы белка 2. Метод был применен позже количественное исследование метастабильных амилоидных белков собраний, в том числе Ар 10, прионных болезней и связанных PrP Sc 11 и α-синуклеина 12. Наиболее важными факторами, которые необходимо учитывать при проектировании эксперимента PICUP являются реагента стехиометрии, время облучения, а также порядок подготовки проб. Бывший два вопроса может потребовать эмпирического оптимизации, в то время как последний вопрос в значительной степени влияет на интерпретацию экспериментальных данных. Для амилоидогенный белков, в частности, определение размера распределения метастабильных олигомеров требует использования агрегатно-бесплатный стартовый препаратов. Фон, механизм, приборостроение, протокол, оптимизация, рамки, изменения, приложения и ограничения PICUP были освещены в предыдущих публикациях 1,2,13. PICUP может быть использован для создания стабильной, растворимые олигомеры белка, что после фракционирования и очистки, могут быть использованы для структурных исследований, цитотоксичности, олигомеризации-торможение исследований, а также в качестве мишеней для развития молекулярной распознавания инструментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами AG027818 и AG030709 из NIH / НИА, 2005/2E от Ларри Л. Hillblom Фонда IIRG-07-58334 от болезни Альцгеймера Ассоциации, а 07-65798 от Калифорнийского департамента здравоохранения.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp d–s not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chase | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).
- Kluger, R., Alagic, A. Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols. Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).
- Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes. Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays. Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).
- Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands. Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies). Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).
- Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions. Amyloid. 13, 67-77 (2006).
- Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking. Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).
- Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking. Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).
