Summary
変更されていないタンパク質（PICUP）の光誘起架橋は、準安定タンパク質混合物のオリゴマーのサイズ分布の特性評価が可能になります。とアミロイドβ-蛋白質、およびカルシトニンの42残基のフォーム、およびコントロールペプチド成長ホルモン放出因子 - 私たちは、3つの代表的なアミロイドペプチド40にPICUPのアプリケーションを示しています。
Abstract
毒性オリゴマーへのアミロイド蛋白質のアセンブリは、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病、遺伝性の筋萎縮性側索硬化症、および2型糖尿病を含むタンパク質のミスフォールディング病の病因に重要な出来事です。これらのタンパク質のアセンブリの準安定な性質のおかげで、それはそのような電気泳動、クロマトグラフィー、蛍光、または動的光散乱などの古典的な方法を用いて定量的にそのオリゴマーのサイズ分布を評価するのは困難である。アミロイド蛋白質のオリゴマーはオリゴマーがモノマーに解離すると同時に、大きなアセンブリに関連付けるれる準安定混合物として存在している。 PICUPは共有結合架橋やドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS - PAGE）やサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）などの分画法と組み合わせた場合、PICUPがクロスする前に存在したオリゴマーのサイズ分布のスナップショットを提供することによりオリゴマーの個体数を安定化 - リンク。したがって、PICUPは準安定タンパク質集団の可視化と定量分析を可能にし、シーケンスの変更とオリゴマー化の間に組み立てと解読の関係を監視するために使用することができます。
Protocol
1。ペプチドの準備
- 秤量〜というラベルの付いた、シリコンでコーティングされた、低吸着剤マイクロチューブに微量天秤および転送を使用して凍結乾燥したペプチド100〜200μgの。ここで、我々は、Aβ40のヒト配列、Aβ42、カルシトニン、およびGRFを使用してください。
- ここで、我々は均一な、集約フリーの準備を取得するためにペプチド1,1,1,3,3,3 - ヘキサフルオロ-2 - プロパノール（HFIP）で前処理を使用してください。予め形成された凝集体は、実験5の間で再現性の低下につながるアミロイド蛋白質の迅速な集約を、誘発するため、この手順が必要となります。そのようなろ過やSECのような他の方法もPICUP 6の集約-フリーの準備を取得するために使用することができます。
- HFIPを有するペプチドを治療するために、適切な保護（HFIPは揮発性と毒性がある）を身に着けているヒュームフード内部の氷の上にHFIPコンテナを事前に冷やします。 250mlのボトルの冷却は、通常、10〜15分が必要です。 0.5mMの名目上のペプチドの濃度を得るためにペプチドの凍結乾燥を含むあらかじめ冷却管にHFIPを追加。
- 室温で5分間水浴の超音波処理のペプチドソリューションを超音波処理してください。
- 穏やかに攪拌し、室温で30分間チューブをインキュベートする。
- 氷上でチューブを（1分間）寒さ、および標識された0.6 mlの低吸着チューブ10 - 50 -μLアリコートにソリューションを分ける。
- 窒素の気流下で蒸発させてHFIPを削除する、または一晩換気フードのオープンチューブを残す。一晩蒸発するため、ラック内の開いているチューブを配置し、ほこりや微粒子の汚染を防ぐために、キムワイプの大きなシートでそれらをカバーしています。
- 凍結乾燥機で真空下での残りのHFIP、または30分間、または2時間真空入口に接続されているexsiccatorで遠心濃縮器をカラカラに乾燥させる最終製品は、マイクロチューブの下部にあるペプチドフィルムになります。適切に無水亜硫酸場合、チューブを-20または-80℃で長期間（数ヶ月）のために気密保存することができます。
2。 HFIP処理ペプチドを可溶化すると写真が架橋
- 架橋反応は、架橋と消光試薬を準備する一つのニーズにHFIP処理ペプチドを可溶化する前に。
- 過硫酸アンモニウム（APS、ミスター228.2グラム/モル）を秤量し、10mMリン酸ナトリウム、20 mM溶液、pH7.4を準備する。溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混ぜる。
- 10 mMリン酸ナトリウム中のトリス（2,2 - ビピリジル）ジクロロ（II）六水和物（RuBpy、氏748.63グラム/モル）、pH7.4の1mMの溶液を調製します。ボルテックスを用いて混合し、完全な溶解を確認してください。アルミ箔を使用して光からチューブを保護します。
- 架橋結合は、次のSDS - PAGE解析のために、便利な消光試薬は、2の5％β-メルカプトエタノール× SDS - PAGEサンプルバッファーです。また、脱イオン水または適当なバッファー中で1 Mジチオスレイトール（DTT、ミスター154.5グラム/モル）を使用することができます。
- HFIP処理ペプチド膜を希NaOHで最初に溶解され、その後、リン酸ナトリウム緩衝液は、〜30μMのペプチドの濃度を得るために追加されます。追加60mMのNaOHは水酸化ナトリウムと水がそれぞれ10と、最終的な体積の45％を、構成するようなペプチドフィルムを含むチューブに精製水が続きます。先端、ピペッティングにより混合し、水浴の超音波処理で5分間超音波処理を用いてマイクロチューブの内壁からペプチドフィルムをこすり落とす。
- 45パーセント20 mMリン酸ナトリウム、pH7.4の、ピペッティングにより混和し、10分間16,000 gで遠心分離を追加。ネガティブコントロールの消光試薬と混合交差を解くにリンクされたペプチドのアリコートを脇に置きます。
- 1秒間にカメラのシャッターの遅延を調整する高い照射時間で、豊富なラジカル反応は、タンパク質分解を引き起こす可能性があります。カメラのシャッターをロードする。照射時間は、新しいタンパク質を持つメソッドを使用するときに最適化する必要があります。
- 典型的なPICUP反応は20μlの反応容量で実行されます。 、薄肉、明確な0.2 mlのPCRチューブにペプチド溶液18μlを。
- ペプチド溶液に、1μlのAPSが続く1μlのRuBpyを追加し、（反応混合物中のRuBpyとAPSの最終濃度はそれぞれ0.05および1mMの、となる）ピペッティングにより試薬を混合する。
- すぐに1.8 mLのガラスバイアルの内部に反応チューブを置きます。カメラ本体の前面に取り付けられたベローズ内部にバイアルを置きます。レンズプロテクターを取り付け、試料はベローズ内部の1秒間照射されるように、シャッターを押してください。
- サンプルの照射後、すぐにバイアルからベローズとPCRの管からバイアルを取り出す。すぐに1μlのDTTまたはPAGEサンプルバッファーを減らす10μlを添加することにより反応をクエンチ。各ペプチドのアリコートに対して反応を繰り返します。
- 反応混合物は、現在7日間より長くのためのストレージのために-20℃で凍結またはSDS - PAGEおよび銀染色によって分析する前に氷上で保存することができます。
3。 SDS - PAGEとスライバー染色架橋ペプチド製品の
- ルーチンSDS - PAGEおよび銀染色、架橋ペプチドを可視化するために実行されます。
- レーンあたりペプチドの約130 pmolのを取得するために車線ごとの反応混合物の5μlをロードします。
- 比較のために交差を解くにリンクされたペプチドの類似の額が含まれております。ペプチドのバンドの分子量を視覚的に近似するための標準的なタンパク質ラダーをも含まれています。
- 標準的なゲル電気泳動装置を用いてゲルを実行します。我々は、InvitrogenからX細胞SureLockミニセルシステムを使用し、Invitrogen社出版IM - 1002、NOVEXプレキャストゲル電気泳動のガイドにしたがって銀染色を行う。
パート4：代表的な結果（図1）
図1：交差を解くにリンクを示す銀染色ポリアクリルアミドゲル（ - ）と（+）光架橋GRF、カルシトニン、Aβ40、Aβ42および
SDS - PAGEとPICUP生成されたAβ40オリゴマーの銀染色分析は、より高いオリゴマー7の存在量の急激な減少が続く四量体を介して単量体の約類似のバンド強度を、示す。交差を解く連動型Aβ40は、モノマー7のそれと一致して氏に移行されます。 Aβ42は異なるオリゴマーのサイズ分布を示しています。 Aβ42オリゴマーは2-3グループ8を備える。最初のグループ、三量体を介して単量体は、増加するオリゴマーの順で減少する強度を表示します。第二のグループでは、ガウス状の分布は、五量体および六量体で最大で、四量体と量体との間で観察される。ここに示されていない第三のグループは、、氏〜30,000-60,000ダ8のオリゴマーが含まれています。これらの高いMRのオリゴマーは、一般的にSEC -孤立LMWAβ42がろ過またはHFIPの治療6で準備ができていないペプチドを用いて観察される。交差を解くにリンクされたAβ42は、主に二つのバンド、単量体のバンドとSDS 5,9により誘導される人工物である幅広いトリマー/四量体のバンドを、生成する。カルシトニンは強くダイマー、トリマー、テトラマーおよび7のプレ存在を示唆し、四量体を介して地域のモノマーの単調指数関数的に減少から分岐オリゴマーのサイズ分布が得られます。コントロールペプチド、GRFは、二量体からオリゴマーの見かけの相対量が増加して分子量を指数関数的に減少するような六量体までの範囲で単調性オリゴマーの分布を生成します。他の実験では、より高いオリゴマーは、7を視覚化することができます。正確な数とオリゴマーのバンドの相対強度は、実際のタンパク質濃度、ゲル上にロードされたタンパク質の量、および銀染色のプロトコルの開発のステップのために使用される時間に応じて実験の間で多少異なる場合があります。
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Discussion
PICUPは、安定したタンパク質複合体2を研究するためにもともと開発されました。メソッドは、Aβ10、プリオンと疾患関連PrP Scが11、およびα-シヌクレイン12を含む準安定アミロイドタンパク質の集合体の定量的研究、に後から適用されました。 PICUPの実験を設計する際に考慮しなければならない最も重要な要因は、試薬の化学量論、照射時間、及び試料調製の手順です。後者の問題は主に実験データの解釈に影響するのに対し、前者二つの問題は、経験的な最適化が必要な場合があります。特にアミロイド生成性タンパク質については、準安定オリゴマーのサイズ分布の決定は、集約フリー出発の準備を使用する必要があります。背景、メカニズム、計測機器、プロトコル、最適化、適用範囲、変更、アプリケーション、およびPICUPの制限は、以前の出版物1,2,13で覆われていた。 PICUPは、以下の分画と精製、構造解析のために使用される可能性、細胞毒性アッセイ、オリゴマー化阻害の研究、および分子認識ツールの開発のターゲットとして、その安定した、可溶性タンパク質のオリゴマーを生成するために使用することができます。
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Acknowledgments
この作品は、公衆衛生のカリフォルニア部からラリーL. Hillblomアルツハイマー病協会から財団、IIRG - 07から58334まで、および07から65798からNIH / NIA、2005/2Eからの補助金AG027818とAG030709によってサポートされていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp d–s not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chase | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
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