Summary
光致交联未修改的蛋白质（PICUP）允许低聚物在亚稳态的蛋白质混合物的粒度分布的特性。我们展示PICUP应用程序的三个有代表性的淀粉样肽的40 - 42残留的淀粉样β-蛋白和降钙素形式，控制肽生长激素释放因子。
Abstract
淀粉样蛋白装配成有毒的低聚物是蛋白质错误折叠疾病，包括阿尔茨海默氏症，帕金森氏症，亨廷顿氏病，遗传性肌萎缩性脊髓侧索硬化症，与2型糖尿病的发病中的一个开创性的事件。由于这些蛋白质组件的亚稳的性质，它是很难用传统的方法，如电泳，色谱仪，荧光，或动态光散射，定量，以评估他们的齐聚物的粒度分布。淀粉样蛋白的低聚物存在亚稳态的混合物，其中的低聚物分解成单体，同时关联到更大的集会。 PICUP稳定的共价交联PICUP时，分馏的方法，如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）或体积排阻色谱法（SEC），相结合，提供快照齐聚物的粒度分布，前交叉存在的低聚物人口联。因此，PICUP使亚稳态蛋白人群的可视化和定量分析，可用于监控大会和破译关系之间的序列修改和齐聚
Protocol
1。肽制剂
- 称取冻干肽100-200微克使用天平和转移到标记，涂硅，低吸附离心管。在这里，我们使用人类序列的Aβ40，Aβ42，降钙素和GRF。
- 在这里，我们使用1,1,1,3,3,3 - 六氟-2 - 丙醇（异丙醇）预处理后，获得均匀，总无准备的肽。这一步是必要的，因为预先形成的集合体导致淀粉样蛋白的快速聚集，导致实验 5之间的重复性差。如过滤和美国证券交易委员会的其他方法也可以用于获取PICUP 6总的准备。
- 为了治疗异丙醇肽，阴寒内通风穿着适当的保护罩（异丙醇挥发和有毒）冰异丙醇容器。一个250毫升的瓶子冷却通常需要10-15分钟。加入预冷管含有肽lyophilizates获得一个0.5毫米的名义肽浓度的异丙醇。
- 超声肽的解决方案为在室温下5分钟的水浴sonicator。
- 涡轻轻地在室温下30分钟的孵育管。
- 冷藏冰（1分）管，并分为10 - 50 -μL分装在标有0.6毫升低吸附管的解决方案。
- 删除下一个温柔的氮流蒸发异丙醇，或离开管在通风柜中打开过夜。一夜之间蒸发，放置在一个机架上的开放式管，并用大板，以防止灰尘和微粒污染的Kimwipes覆盖。
- Exsiccate在冷冻干燥机， 在真空中剩余的异丙醇或离心浓缩为30分钟，或在2小时真空入口exsiccator最终产品将在肽膜的离心管底部。如果正确exsiccated，可存储管（月）长时间密闭在-20或-80 ° C。
2。溶异丙醇处理的肽和照片交联
- 在溶异丙醇处理的肽交联反应，需要准备交联和淬火试剂。
- 称取过硫酸铵（APS，议员228.2克/摩尔），并准备在10 mM磷酸钠，pH 7.4的20毫米的解决方案。混合使用一个旋涡，直到解决的办法是明确的。
- 准备在10 mM磷酸钠，pH值7.4 1毫米的Tris溶液（2,2 - 联吡啶）dichlororuthenium（二）六水（RuBpy，议员748.63克/摩尔）。混合使用一个旋涡，并确认完全溶解。保护使用铝箔的光管。
- SDS - PAGE分析以下交联，一个方便的淬火试剂是5％β-巯基乙醇，在2 × SDS - PAGE样品缓冲液。另外，1米二硫苏糖醇（DTT，议员154.5克/摩尔）在去离子水或适当的缓冲区可以使用。
- 异丙醇治疗肽片溶解于稀氢氧化钠第一和磷酸钠缓冲液，然后添加到〜30微米肽浓度。其次是去离子水含有肽电影等，氢氧化钠和水构成分别为10和45％的最终体积管加入60 mM的氢氧化钠。刮去使用离心管尖，向上和向下吹打混合，超声为5分钟在水浴sonicator内壁肽电影。
- 添加45％20 mM磷酸钠，pH值7.4，由吹打混合，并在10分钟的16000克离心机。抛开uncross挂钩肽与阴性对照淬火试剂混合等份。
- 调整相机的快门延迟为1秒。在较高的照射时间，大量的自由基反应可能会导致蛋白质的降解。装入相机的快门。照射时间可能需要优化时使用一个新的蛋白质的方法。
- 一个典型的PICUP反应是在20μl的反应。转移到一个薄壁的，明确的，0.2毫升PCR管18μL肽的解决方案。
- 肽的解决方案，添加1μLRuBpy 1μL的APS和混合试剂移液器（RuBpy和APS终浓度在反应混合物将分别为0.05和1毫米，）。
- 快速放置在反应管内的1.8 mL的玻璃小瓶。放置在相机机身的前面附加波纹管内的小瓶。将镜头保护盖和按快门，使样品照射1波纹管内的小号。
- 样品照射后，迅速采取波纹管和PCR管瓶小瓶中。快速淬火，加入1μL的DTT或10μL减少PAGE样品缓冲液的反应。重复每个肽等分的反应。
- 反应混合物现在可以不再超过7天，或放在冰上SDS - PAGE电泳和银染分析前冷冻储存在-20 ° C。
3。 SDS - PAGE和银染色交联肽产品
- 常规SDS - PAGE电泳和银染进行可视化交联肽。
- 装入5μL反应混合物中的每通道获得每巷肽〜130 pmol。
- 包括比较类似的uncross相连的肽。还包括一个标准蛋白分子量肽乐队的视觉逼近的阶梯。
- 运行使用一个标准的凝胶电泳仪凝胶。我们使用自Invitrogen XCell SureLock小型电池系统，并按照Invitrogen公司出版IM - 1002，NOVEX预制凝胶电泳指南进行银染。
第4部分：代表性的结果（图1）
图1：银染聚丙烯酰胺凝胶电泳显示uncross挂钩（ - ）及光交联（+），GRF，降钙素，Aβ40和Aβ42
SDS - PAGE和银染分析显示PICUP产生的Aβ40低聚物单体大致相同，通过四聚体带的强度，其次是一个在更高的低聚物7丰度的急剧下降。 Uncross联系Aβ40迁移与先生与单体7一致。 Aβ42显示了独特的低聚物的粒度分布。 Aβ42的低聚物包括2-3组8。第一组，通过三聚体单体，显示越来越低聚物秩序的力度递减。在第二组中，高斯状分布，是观察之间的四聚体，heptamer，最多五聚体和六聚体。第三组，这是这里没有显示，包含先生〜8 30,000-60,000大的低聚物。这些较高的议员，低聚物通常使用Aβ42的低分子量SEC隔离观察，但不肽准备通过过滤或异丙醇治疗 6 。 Uncross挂钩Aβ42的产生主要是两个频段，单体带和广阔的三聚体/四聚体带，这是一个人工制品经SDS 5,9诱导。降钙素产量低聚物的大小分布，强烈发散通过四聚体的地区单体单调指数下降，表明预存在，二聚体，三聚体和四聚体7。控制多肽，GRF，产生一种单调的低聚物分布范围从二聚体通过六聚体等，明显的相对含量低聚物分子质量的增加呈指数下降。在其他实验中，较高的低聚物也可以可视化7。确切的数字和低聚物带的相对强度实验是根据实际的蛋白浓度，凝胶上装载的蛋白质的量，并在银染协议的开发步骤中所用的时间可能会有所不同。
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Discussion
PICUP最初开发研究稳定的蛋白复合物 2 。该方法应用定量研究亚淀粉样蛋白的组件，包括Aβ 的 10朊病毒疾病相关的PrP SC 11和α-突触核蛋白 12 。 PICUP实验设计时必须考虑的最重要的因素是试剂的化学计量学，激光照射时间，和样品制备过程。前两个问题，可能需要实证的优化，而后者的问题在很大程度上影响实验数据的解释。特别是对于淀粉样蛋白，亚稳低聚物的粒度分布的测定需要使用总量开始筹备工作。背景，机制，仪器仪表，协议优化，范围，修改，应用程序，并PICUP限制包括在1,2,13以前的出版物。 PICUP可用于生成稳定，可溶性蛋白的低聚物以下分馏和净化，可用于结构的研究，细胞毒性实验，齐聚抑制研究和分子识别工具的发展目标。
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Acknowledgments
这项工作得到了拉里L ·希尔布鲁姆基金会，IIRG - 07 - 58334，从老年痴呆症协会，和来自加利福尼亚州公共卫生部07-65798和NIH / NIA的，2005/2E补助AG027818 AG030709。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp d–s not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chase | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
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