Summary
Tradycyjnie w pionie kawałek i cały montażu przygotowanie siatkówce były używane w badaniach funkcji siatkówki obwodów. Poniżej opiszemy powieści krojenia metody zachowania dendrytycznych morfologii neuronów siatkówki nienaruszone.
Abstract
Tradycyjnie w pionie kawałek i cały montażu przygotowanie siatkówce były używane w badaniach funkcji siatkówki obwodów. Jednak wiele neuronów siatkówki, takie jak amacrine komórek, rozszerzać swoją dendrytów poziomo, tak że morfologia komórek ma być poważnie uszkodzony w pionowe plastry. W całym montażu przygotowania, zwłaszcza dla patch-clamp nagrań neuronów siatkówki w środkowej warstwie nie są łatwo dostępne ze względu na rozległy zasięg glejowych komórek (komórki Mueller) endfeets s. Poniżej opiszemy powieści krojenia metody zachowania dendrytycznych morfologii neuronów siatkówki nienaruszone. Kawałek został poziomo po wewnętrznej warstwy siatkówki za pomocą vibratome Krajalnica po siatkówki został osadzony w niskiej temperaturze topnienia żelu agarozowym. W tym poziome przygotowania kawałek siatkówki, badanych przez nas funkcji neuronów siatkówki w porównaniu z ich morfologii, za pomocą patch-clamp nagrywania, techniki obrazowania wapnia, immunocytochemii i pojedynczych komórek RT-PCR.
Protocol
- Przygotowanie bloku agar (30 mg / ml, tj. 3%, w wodzie destylowanej). Rozpuścić i kuchenka mikrofalowa to pierwszy i przelać do naczynia szklanego. Przechowywać pojemnik w lodówce w temperaturze 4 ° C.
Wskazówka: Blok agar powinny być przygotowane wcześniej.
- Przygotuj się do niskich temperatur i topnienia żelu agarozowym (25 mg / ml, tj. 2,5%, w średnich). Rozpuścić i mikrofalówka to. Trzymaj go w gorącej łaźni wodnej w temp. 35 o C.
Wskazówka: Należy żelu agarozowym nie za gorąco. Jeśli jest zbyt gorąco, to zajmuje dużo czasu, aby być zestalone, a żel może zabić w siatkówce
. - Eutanazji zwierząt, wyłuszczyć gałki ocznej i otwórz go w muszlę oczną. Aby stopić ciała szklistego, otworzył muszla oczna jest moczony przez 10 minut w hialuronidazy w średnim (0,07 mg / ml), jeśli koniecznie.
- Cut agar w bloku (np. 1 cm x 1,5 cm do siatkówki myszy) i przymocowane na stałe na vibratome scenie kleje. Przechowywać bloku agar mokre.
- Umieścić ostrze w 5 stopni na krajalnicy. Delikatnie cięcia górnej powierzchni bloku agar z prędkością ok.. 50 ľm / s, Częst. 50 Hz.
Wskazówka: Upewnij się, że górna powierzchnia bloku agar jest całkowicie gładka i płaska. Kilka kawałków (co najmniej 3 razy) mogą być potrzebne, aby uzyskać gładką i płaską powierzchnię bloku agar.
- Przepłukać muszla oczna z medium bez hialuronidazy. Isolate siatkówki z nabłonka barwnikowego i umieścić ją fotoreceptorów do dołu na kawałku bibuły filtracyjnej. Aby mocno przywiązują siatkówki do bibuły, próżni siatkówki na filtr papierowy kilka razy.
Wskazówka: Upewnij się, że siatkówka jest dołączony do bibuły całkowicie płaskie. Po umieszczeniu siatkówki na bibule filtracyjnej, wyciąć nadmiar bibułę wokół siatkówki (rys.2a). Nadmiar bibułę często uniemożliwia ostrze przejdzie w odpowiednie warstwy siatkówki.
- Delikatnie wytrzyj nadmiar medium na bloku agar i dokładnie miejsce w siatkówce na bibule filtracyjnej w bloku agar. Aby trwale umieścić bibułę filtracyjną w bloku agar, dołączyć kleje na krawędzi bibuły.
Wskazówka: Aby uniknąć nieoczekiwanie crack, miejsce na siatkówce, jak z przodu, jak to możliwe na górnej powierzchni bloku agar.
- Delikatnie wlać do niskich temperatur i topnienia żelu agarozowym w siatkówce. Poczekaj na 1 min i delikatnie wlać medium na to, aby ostudzić. Żelu agarozowym staje się zestalone szybko.
Wskazówka: Za gorąco żelu agarozowym zabija siatkówki.
- Podnieś pozycję ostrza do kilkuset mikrometrów powyżej górnej powierzchni bloku agar i delikatnie wyciąć góry zestalony żelu agarozowym.
- Niżej pozycji ostrza. Cut siatkówki na poziomie bliższym jedna trzecia warstwa wewnętrzna jądrowej (ok. pomiędzy 200 a 250 mikrometrów powyżej górnej powierzchni bloku agar).
Wskazówka: Za dużo prędkości ostrze uszkodzić siatkówkę poważnie. Ok. 50 ľm / s (50 Hz) jest odpowiednia.
- Zauważ, że amacrine komórki są teraz zakryte. Ostrożnie podnieś kawałek siatkówki wraz z zestalonego żelu agarozowym i umieścić ją odkrytą w komorze lub danie.
Wskazówka: Ponieważ siatkówki myszy jest bardzo mała i faliste, trudno jest uzyskać doskonałe poziomego wycinka w odpowiedniej warstwie. "Ukośny" slice może być metodą alternatywną do uzyskania względnej płaski kawałek siatkówki. Aby uzyskać ukośne kawałek, umieścić inny filtr papieru między siatkówki na bibule filtracyjnej i blok agar, jak pokazano na Fig.2B. Chociaż nie można oczekiwać doskonałej poziomego wycinka, zawsze są pewne obszary, gdzie amacrine komórki soma jest na powierzchni warstwy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Istnieje kilka ważnych zalet poziomej przygotowania kawałek siatkówki.
Po pierwsze, morfologii komórek, które rozszerzają się dendrytów w poziomie, jak amacrine i komórki w poziomie, jest zachowany. Wykazano, że istnieje ponad 20 rodzajów amacrine komórek w siatkówce (MacNeil i Masland, 1998), tak że jest bardzo ważne dla porównania morfologii komórek fizjologiczne własności.
Po drugie, w całym montażu siatkówki, obszerne relacje z komórek glejowych s endfeets uniemożliwia dostęp do pipet patch do amacrine komórek. W poziome plastry, soma z amacrine komórek jest narażony na powierzchni plasterki.
Po trzecie, odczynniki chemiczne mogą łatwo dotrzeć do komórek docelowych i ich dendryty, ponieważ znajdują się one na powierzchni plasterki. Wash-in i wymywania substancji chemicznych łatwo i szybko.
Po czwarte, fluorescencyjne obrazowania jonów, takich jak konwencjonalne obrazowanie wapnia jest wykonalne. W tradycyjnych plastrów pionowej lub całego montażu siatkówki, światła wzbudzającego do obrazowania się aktywuje fotoreceptorów. W poziomie przygotowania slice, fotoreceptory i photopigments są całkowicie usuwane, tak, że nie ma skażenia wzbudzenia światło wywołane artefakty. Ponadto, stosunek sygnału do szumu obrazu jest znacznie wyższa, ponieważ działalność tle fotoreceptorów jest wyeliminowane. Największą wadą poziomej przygotowania kawałek jest pionowe połączenie fotoreceptorów i komórek zwojowych jest pocięte, tak że nie ma wizualne przetwarzanie informacji w przekroju.
Ta technika ma zastosowanie do siatkówki standardowej zwierząt, takich jak złote rybki, myszy i królików (Fig.1B). Metoda poziomego wycinka może zaoferować alternatywny sposób w badaniu funkcji neuronów i obwodów nerwowych w siatkówce.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wszystkie protokoły eksperymentalne były prowadzone zgodnie z National Institutes of Health wytyczne do stosowania u zwierząt.
Acknowledgments
Dziękujemy dr. Richard H. Masland i Akimichi Kaneko za udzielenie nam cennych rad i sugestii w celu ustalenia procedury poziomej przygotowania kawałek siatkówki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Low-temperature melting agarose |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | ||
| Microwave | |||
| Hot water bath | 35 °C | ||
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membrane filters | EMD Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 µm |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | ||
| Instant glue | e.g. Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL Syringe | |||
| Syringe filter | EMD Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
