Summary
We presenteren een methode voor het genereren van cDNA van milieu-mRNA. In het algemeen, totaal RNA eerste is verzameld uit de omgeving, is rRNA selectief verwijderd, mRNA wordt selectief versterkt, en cDNA gesynthetiseerd uit de verrijkte mRNA zwembad is gesequenced. Herstelde sequenties kunnen worden geannoteerd met behulp van standaard bioinformatica technieken om de uitdrukking genen te identificeren.
Abstract
Analoog aan metagenomics, milieu transcriptomics (metatranscriptomics) haalt en sequenties milieu-mRNA's van een microbiële assemblage zonder voorafgaande kennis van wat genen van de gemeenschap zou kunnen uiten. Zo biedt de meest onpartijdige perspectief op gemeenschap genexpressie
Protocol
Werken met RNA
Omdat RNases zijn alomtegenwoordig en mRNA's af te breken snel, standaard voorzorgsmaatregelen voor het werken in een ribonuclease-vrije omgeving moet worden gevolgd en de monsters moeten worden verwerkt of zo spoedig mogelijk na collectie bewaard gebleven.
Deel 1: Milieu-RNA Collection (ontworpen om biomassa te verzamelen in de 0,2 tot 3,0 micrometer groot fractie)
Benodigdheden:
Masterflex buis
Slangenpomp
3 micrometer hoog volume geplooid capsule filter
0,22 micrometer Supor of polycarbonaat 142 mm filter
142 mm filter toren (Geotech Environmental Equipment)
10-20 L mandfles (afgestudeerd)
Whirl Packs
Vloeibare stikstof
RLT buffer (Qiagen)
Beta-mercaptoethanol
Setup:
Schone handschoenen gedragen worden wanneer het hanteren van de filters of het aanraken van een van de interne onderdelen van de filter lijn. Pincet moet worden bewaard in een schone, 50 ml conische buizen, bij voorkeur gevuld met ethanol. Om te voorkomen dat grote veranderingen in het transcript zwembad, houd filtering en behandelen van het monster zo kort mogelijk te houden.
Plaats het ene uiteinde van de slang in het water op de gewenste diepte voor bemonstering. Aan de andere kant, bevestigt het hoge volume 3 micrometer filter. Sluit de 3 micrometer filter om de 0,22 um filter toren. Richt de uitstroom uit de 0,22 urn in een maatkolf mandfles.
Procedure:
- Run meerdere liters water door het systeem (geen 0,22 um filter) te spoelen. Wanneer u klaar bent, verwijder de slangen uit het water, terwijl de pomp draait om het resterende water te zuiveren van de lijn.
- Met behulp van een tang, plaats een 0,22 um filter op het filter toren en te sluiten.
- Plaats het uiteinde van de lijn terug in het water en zet de pomp. Zuiveren de lucht van zowel de filters. Monitor de hoeveelheid water gefilterd met het afstuderen op de mandfles.
- Wanneer het gewenste volume is gefilterd, verwijder dan de lijn van het water en zuiveren het resterende water uit het systeem.
- Zodra het filter droog is, snel te verwijderen van de bovenste filter plaat en vouw het filter. Plaats het filter in een maalstroom pack of 15 ml collectie buisje met 2 ml van RLT buffer met beta-mercapto-ethanol. Snap bevriezen in vloeibare stikstof.
Deel 2: Totaal RNA-extractie van 0,22 um filter
Dit deel maakt gebruik van de QIAGEN RNeasy mini kit met modificaties aan instructies van de fabrikant
- Bereid kraal slaan buizen door het toevoegen van 8 ml van RLT buffer (beta-mercapto-ethanol toegevoegd) aan een 50 ml conische buis. Voeg 1-2 ml van RNA kralen uit een MoBio Powersoil extractie kit
- Snel de bevroren filter te verwijderen uit de diepvries, en houden deze in de roes pak, verbrijzelen met een hamer. Als alternatief, snijd de filters in kleine stukjes in de collectie buis (15ml) met behulp van een steriel scheermesje en alles toe te voegen aan de voorbereide tube (50ml).
- Voeg de verbrijzelde filter naar de klaargemaakte buis (50 ml), en sluit de tube deksel met parafilm of lab tape.
- Vortex gedurende 10 minuten op topsnelheid met behulp van een vortexer met een bijlage voor 50 ml buizen.
- Centrifugeer de 50 ml buis bij 5000 rpm gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
- Verwijder zo veel mogelijk van het lysaat en overbrengen naar een 15 ml buis.
- Centrifugeer de 15 ml buis gedurende 5 min bij 5000 x g.
- Transfer supernatans (~ 7 ml) om een nieuw 50 ml buis.
- Voeg een volume (~ 7 ml) van 100% EtOH aan het lysaat.
- Met behulp van een 30 ml spuit, dat past in de 50 ml buis, trek het lysaat omhoog door een 18-21 gauge naald en weer doorgeven van ~ 5 keer. Wanneer u klaar bent, laat het lysaat in de spuit.
- Ga door met de extractie met de QIAGEN RNeasy Mini kit. Het is nuttig om een vacuum spruitstuk hier gebruiken, want het lysaat volume (~ 14ml) is veel hoger dan de originele kit-protocol (0,7 ml). Als alternatief kan het lysaat worden getrokken door door het toevoegen van 700 ul van de kolom, centrifugeren, en herhalen totdat alle van het lysaat is toegepast op de kolom.
- Plaats een spin column over het vacuüm spruitstuk en toe te passen 700 ul van het monster. Van toepassing zijn vacuüm druk om het verdeelstuk te trekken naar beneden het lysaat. Ga door het toevoegen van de lysaat van de spuit totdat al het is toegepast op de kolom.
- Voeg 700 ul buffer RW1 de kolom en trek naar beneden met vacuüm druk.
- Voeg 500 ul buffer RPE op de kolom en trek naar beneden met vacuüm druk.
- Voeg een tweede hoeveelheid van 500 ul buffer RPE op de kolom en trek naar beneden met vacuüm druk.
- Zodra het wassen volledig is getrokken door, verwijder de kolom en in een collectie buis.
- Centrifugeer de buis gedurende 1 minuut bij 8000 x g. Gooi flow-through.
- Centrifugeer een extra 2 min op 8000 xg om zich te ontdoen van de EtOH.
- Transfer kolom naar een nieuwe 2 ml colmeling buis. Pipetteer 35 ul van RNase-vrij water direct op het membraan. Sluit buis en laten staan gedurende 1 minuut.
- Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 8000 x g.
- Spectrofotometrisch kwantificeren van de totaal RNA.
Deel 3. DNAse behandeling
Dit deel maakt gebruik van de Ambion TURBO DNA-free kit volgens de instructies van de fabrikant
- Voeg 3,4 pl 10x DNase I Buffer en 1μl rDNase ik naar de RNA monster.
- Incubeer bij 37 º C gedurende 30 minuten.
- Vortex de DNase Inactivatie Reagens en voeg 3,4 pl van de inactivatie reagens aan het monster.
- Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur met af en toe mengen.
- Draaien op 10.000 xg gedurende 1,5 min bij kamertemperatuur, vervolgens over de supernatant naar een nieuwe buis. Voorkomen dat de introductie van de inactivatie reagens in de nieuwe buis.
Deel 4. Eerste rRNA verwijderen
Dit deel maakt gebruik van de Epicentre mRNA-ONLY kit volgens de instructies van de fabrikant
- Voorzichtig mengen en kort voordat centrifuge de mRNA-ONLY 10X reactiebuffer te gebruiken.
- In een steriele (RNase-vrij) 0,5 ml tube, combineren de volgende reactie componenten op het ijs:
mRNA-ONLY 10X reactiebuffer 2,0 pl RNase Inhibitor 0,5 pl Totaal RNA Sample (200 ng-10 ug) 16,5 ul Terminator exonuclease (1 Unit) 1,0 pl Totale volume 20,0 ul - Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 60 min in een thermocycler (met verwarmde deksel) of waterbad.
- Beëindig de reactie met Phenol / EtOH neerslag:
- Voeg RNase-vrij H2O tot een totaal volume van 200 ul (= 180 pi).
- Extract: fenol: chloroform (1:1), een volume (= 200 pi). Vortex krachtig en dan draaien 2-5 min op topsnelheid.
- Verwijder de waterige fase (~ 200 pi).
- Voeg 0,1 volumes van 3 M natriumacetaat (20 pl) + 2,5 volume van 100% ijskoud EtOH (500 pl)
- Incubeer bij -80 º C voor 15-30 minuten.
- Pellet bij 4 º C, topsnelheid, 30 min, let op de positie van de buis voor latere aspiratie van het monster (pellet kan moeilijk te zien zijn).
- Gooi supernatans met aspirator of pipet.
- Was met 500 pi 70% ijskoud EtOH. Hersuspenderen door vortexen.
- Centrifugeer gedurende 10 min op topsnelheid. Gooi supernatant.
- Centrifuge De overblijvende vloeistof in buis weer 10 min op topsnelheid.
- Zorgvuldig aspireren vloeibare en volledig droge pellet door het verlaten van het open voor ~ 10 min onder de motorkap.
- Resuspendeer in 15-20 ul RNase-vrij H2O (maximaal ingang volume van MICROBExpress is 15 pi), laat het staan voor 5 min bij kamertemperatuur.
- Gebruik Bioanalyzer of Experion om te controleren op besmetting rRNA en de kwaliteit van mRNA bij deze stap.
- Dit is een potentieel stopplaats. RNA kan worden opgeslagen bij -80 º C opslag.
Deel 5. Tweede rRNA verwijderen
Dit deel maakt gebruik van de Ambion MICROBEnrich en MICROBExpress kits volgens de instructies van de fabrikant. Beide kits kunnen meerdere keren worden gebruikt om de efficiëntie van eukaryotische (MICROBEnrich) en prokaryotische (MICROBExpress) rRNA verwijdering te verhogen. De inbreng van totaal RNA moet tussen 2-10 ug. Het volume van RNA moet minder dan 15 ul worden. Zo is de ideale invoerapparaat is> 150 ng / ul. -
MICROBEnrich
- Pipetteer 300 ul Binding buffer in een 1,5 ml buis
- Voeg 500 tot 100 ug totaal RNA in een maximaal volume van 30μl en vortex voorzichtig
- Voeg 2 pl Capture Oligo Mix voor 5 pg RNA in Binding buffer. Tik zachtjes buis en kort spin down van het mengsel.
- Denatureren mengsel bij 70 ° C gedurende 10 minuten
- Gloeien van het mengsel bij 37 ° C gedurende 1 uur. Bereid de kralen tijdens deze incubatie.
- Bereid Oligo MagBeads (meestal 25 pi) door wassen eens in de nuclease-vrij water en een keer in bindende buffer, het vastleggen van de kralen op een magnetische voet tussen de wasbeurten. Bewaar de kralen op het ijs. Warm ze op kamertemperatuur 5 min voor gebruik.
- Verwarm de Wash-oplossing tot 37 ° C in hitte te blokkeren.
- Voeg de RNA / capture Oligo Meng de gewassen Oligo MagBeads. Zeer meng de buis en draai kort.
- Incubeer de mix bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Plaats de buis in de magnetische staan en wacht tot ~ 3 minuten.
- Aspireren supernatant (bevat mRNA) en breng het naar een buis op het ijs.
- Voeg 100 ul voorverwarmde Wash oplossing voor vastgelegde kralen. Voorzichtig vortex de kralen kort. Capture kralen en herstellen supernatant. Zwembad dit supernatant met mRNA in de collectie buis op ijs (~ 450 ul eind volume).
- Plaats de collectie buis op ijs. Als er een tweede ronde zal worden uitgevoerd, gaat u terug naar 5.3) sectie en herhaal de procedure. U kunt ook direct naar de MICROBExpress kit (5,18, zie hieronder).
- Gebruikte OlioBeads kan gebruikt worden voor de tweede keer. Regenereren Oligobeads door incubatie ze met twee volumes (meestal 50 ul) van Regeneratie Oplossing 1 voor 1 uur. Leg de kralen in een magnetisch stand. Twee keer was ze met twee volumes van Regeneratie Oplossing 2 (meestal 50 ul) en resuspendeer ze in hun oorspronkelijke volume van resuspentie oplossing (meestal 25 ul).
MICROBExpress - Pipetteer 200 ul Binding buffer in een 1,5 ml buis.
- Voeg 2-10 ug totaal RNA in een maximaal volume van 15μl en vortex voorzichtig.
- Voeg 4 pi Capture Oligo Mix aan de RNA in Binding buffer. Tik zachtjes buis en kort spin down van het mengsel.
- Denatureren mengsel bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
- Gloeien mengsel bij 37 ° C gedurende 15 min kralen Maak tijdens deze incubatie.
- Bereid Oligo MagBeads door het wassen eens in de nuclease-vrij water, gevolgd door twee wasbeurten in 50 ul Binding buffer, het vastleggen van de kralen op een magnetische voet tussen de wasbeurten. Resuspendeer kralen in 50 ul bindingsbuffer en incubeer bij 37 ° C tot gebruik.
- Verwarm de Wash-oplossing tot 37 ° C in warmteblok
- Vortex gewassen Oligo MagBeads voorzichtig. Voeg 50 ul Oligo MagBeads tot RNA / Oligo Mix vast te leggen. Zeer meng de buis en draai kort.
- Incubeer mengsel bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Plaats de buis in de magnetische staan en wacht tot ~ 3 minuten.
- Aspireren supernatant (bevat mRNA) en breng het naar een buis op het ijs.
- Voeg 100 ul voorverwarmde Wash oplossing voor vastgelegde kralen. Voorzichtig vortex de kralen kort.
- Capture kralen en herstellen supernatant. Zwembad dit supernatant met mRNA in de collectie buis op ijs (~ 350 ul eind volume).
- Als er een tweede ronde zal worden uitgevoerd, ga terug naar paragraaf 5.18) en herhaal de procedure. U kunt ook onmiddellijk overgaan tot neerslag mRNA.
- Neerslag en resuspendeer mRNA:
- Om de gepoolde mRNA toe te voegen 35 pl natriumacetaat en voeg 7 pl glycogeen.
- Voeg 1175 ul ijskoude 100% EtOH en vortex grondig.
- Neerslag bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur.
- Centrifugeer gedurende 30 min bij 10.000 x g.
- Decanteer zorgvuldig Verwijder de bovenstaande vloeistof.
- Voeg 750 ul ijskoude 70% EtOH en vortex kort.
- Centrifugeer gedurende 5 min bij 10.000 xg en gooi supernatant.
- Doe een seconde 70% EtOH wassen.
- Kort respin de buis na het afleggen van de tweede 70% EtOH wassen.
- Verwijder voorzichtig supernatant met een pipet.
- Drogen aan de lucht de pellet gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de RNA pellet in 25 ui TE-buffer of RNase vrij water
- Hydrateren RNA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Vortex het monster krachtig indien nodig.
- Als het nodig is te verwijderen resterende kralen, plaats buis op magnetische staan voor ~ 3min en bewegen verrijkt mRNA naar nieuwe RNase vrij buis.
- Gebruik Bioanalyzer of Experion om te controleren op besmetting rRNA en de kwaliteit van mRNA bij deze stap.
- Dit is een potentieel stopplaats. RNA kan worden opgeslagen bij -80 º C opslag.
Deel 6: mRNA Amplification
Dit deel maakt gebruik van de Ambion MessageAmp II-Bacteriën kit volgens de instructies van de fabrikant. Bereken mastermengsels online op www.ambion.com/tools/ma2bact .
- Polyadenylatie van template RNA:
- Plaats tot 1000 ng van Totaal RNA (meestal 100 tot 500 ng) of tot 500 ng mRNA (meestal 10 ng-200 ng) in een steriele RNase-vrij microfugebuis. Gebruik 6,5 ul van het monster en geen RNase vrij water in de eerste buffer.
- Incubeer 10 min bij 70 ° C, bij voorkeur in een thermocycler.
- Haal de RNA-monsters van de 70 ° C incubator en centrifuge kort (~ 5 s) om te proeven te verzamelen op de bodem van de buis. Leg het mengsel op ijs gedurende 3 minuten.
- Bereid polyadenylatie Master Mix in een nuclease-vrij tube bij kamertemperatuur in de volgorde zoals op het rekenblad. Verzamel genoeg Master Mix voor alle monsters in het experiment, met inbegrip van ≤ 5% overmaat aan pipetteren fout te dekken. Voorzichtig vortex om een homogeen mengsel te maken zonder het inactiveren van het enzym, centrifugeer ~ 5 s om de master mix op de bodem van de buis te verzamelen.
- Overdracht 3,5 pi van polyadenylatie Master Mix aan elk RNA-monster, meng zorgvuldig door zachte vortexen en volgen met een snelle draai om de reactie te verzamelen.
- Plaats de monsters in een 37 ° C incubator. Incubeer reacties voor 15 minbij 37 ° C, vervolgens in het kort centrifuge om de reactie op de bodem van de buis te verzamelen.
- Na de 37 ° C incubatie, plaats de reacties op het ijs en ga onmiddellijk naar de reverse transcriptie.
- Reverse transcriptie te synthetiseren eerste streng cDNA:
- Bereid reverse transcriptie Master Mix in een nuclease-vrij tube bij kamertemperatuur in de volgorde zoals op het rekenblad. Verzamel genoeg Master Mix voor alle monsters in het experiment, met inbegrip van ≤ 5% overmaat aan pipetteren fout te dekken. Voorzichtig vortex om een homogeen mengsel te maken zonder het inactiveren van het enzym, centrifugeer ~ 5 s om de master mix op de bodem van de buis te verzamelen.
- Breng 10 ul van reverse transcriptie Master Mix aan elk monster, meng zorgvuldig door zachte vortexen, en met een snelle draai om de reactie te verzamelen te volgen.
- Plaats de monsters in een 42 ° C incubator. Incubeer 2 uur bij 42 ° C, vervolgens kort gecentrifugeerd (~ 5 s) om de reactie op de bodem van de buis te verzamelen.
- Plaats de buizen op ijs en onmiddellijk overgaan tot de tweede streng cDNA synthese.
- Tweede deel cDNA Synthese:
- Op het ijs, bereiden een tweede streng Master Mix door het mengen van de volgende reagentia in de volgorde zoals in de berekening opgenomen. Verzamel genoeg Master Mix voor alle monsters in het experiment, met inbegrip van ≤ 5% overmaat aan pipetteren fout te dekken. Voorzichtig vortex om een homogeen mengsel te maken zonder het inactiveren van de enzymen, centrifugeer ~ 5 s om de master mix op de bodem van de buis te verzamelen.
- Overdracht 80 ul van Tweede Strand Master Mix aan elk monster, meng zorgvuldig door zachte vortexen, en met een snelle draai om de reactie te verzamelen te volgen.
- Plaats de monsters in een 16 ° C thermal cycler. Het is belangrijk om de thermische cycler blok afkoelen tot 16 ° C voor het toevoegen van de reactie buizen, omdat het onderwerpen van de reacties op temperaturen> 16 ° C zal ARNA opleveren compromis.
- Incubeer 2 uur bij 16 ° C incuberen 2 uur in een 16 ° C thermal cycler. Als het deksel temperatuur kan niet worden aangepast aan de 16 ° C blok temperatuur wedstrijd, dekking van de reacties met de verwarmde deksel uitgeschakeld, of als de klep kan niet worden uitgeschakeld, niet de buizen deksel mee.
- Plaats reacties op ijs kort. Laat de reacties op het ijs voor langere tijd.
- 5.4) cDNA Zuivering:
- Alle centrifugations in deze zuivering procedure moet worden gedaan bij 10.000 xg (meestal ~ 10000 rpm) bij kamertemperatuur. Controleer de cDNA bindende buffer voor neerslag alvorens het te gebruiken. Als er een neerslag zichtbaar is, weer wordt opgelost door opwarming van de oplossing tot 37 ° C gedurende 10 min en vortexen krachtig. Afkoelen tot kamertemperatuur vóór gebruik.
- Voor het begin van de cDNA-zuivering, verwarm de 10 ml flesje Nuclease-vrij water tot 50 ° C gedurende ten minste 10 minuten.
- Voeg 250 ul van cDNA Binding Buffer toe aan elk monster en meng voorzichtig door vortexen.
- Centrifuge voor ~ 1 min bij 10.000 g, of tot het mengsel door het filter. Gooi de doorstroom en vervang de cDNA filterpatroon in de was buis.
- Van toepassing zijn 500 pi wasbuffer aan elke cDNA Filter Cartridge. Centrifuge voor ~ 1 min bij 10.000 g, of tot alle Wash Buffer wordt door het filter. Gooi de doorstroom en draai de cDNA Filter cartridge voor een extra minuten om sporen van EtOH te verwijderen.
- Overdracht cDNA Filter Cartridge om een cDNA Elutie Tube. Elueer cDNA met 20 ul van 50 ° C Nuclease-vrij water. Het is belangrijk om Nuclease-vrij water, dat is bij 50 ° C te gebruiken voor de cDNA elutie. Kouder water wordt minder efficiënt in het elueren van het cDNA, en heter water (> 55 ° C) kan leiden tot verminderde ARNA opbrengst.
- Naar het midden van het filter in de cDNA Filter Cartridge, toe te passen 20 ul van voorverwarmde (50 ° C) Nuclease-vrij water. Laat op kamertemperatuur gedurende 2 minuten en centrifugeer ~ 1,5 min bij 10.000 xg, of totdat alle Nuclease-vrij water wordt door het filter. De dubbel-cDNA wordt nu in de elueren (~ 16 ul).
- De gezuiverde cDNA kan 's nachts worden bewaard bij -80 ° C op dit punt indien gewenst.
- In vitro transcriptie te ARNA Samenstel
- Het wordt aanbevolen om een hybridisatie oven te gebruiken omwille van hun gelijkmatige temperatuur, en omdat het is uiterst belangrijk dat condens niet tot in de buizen. We raden een 14 uur IVT reactie incubatie om ARNA opbrengst te maximaliseren. Voor de hoogste opbrengst ARNA, het gedrag van de IVT in een 40 ul laatste reactie volume.
- Bij kamertemperatuur, monteren een IVT Master Mix door het toevoegen van reagentia in de volgorde die op het rekenblad. Meng goed door voorzichtig vortexen. Centrifuge kort (~ 5 s) naar de Colselecteer de IVT Master Mix op de bodem van de buis en leg ze op ijs.
- Overdracht IVT Master Mix aan elk monster volgens de richtlijnen van het rekenblad, meng zorgvuldig door zacht vortexen, kort centrifuge om de reactie te verzamelen, en plaats de buizen in een 37 ° C incubator.
- Incubeer 14 uur bij 37 ° C.
- Na de incubatie, voeg Nuclease-vrij water aan elk ARNA monster het uiteindelijke volume van 100 ul te brengen. Meng goed door voorzichtig vortexen. Plaats de verdunde ARNA op het ijs als de ARNA zuiveringsstap zal onmiddellijk worden uitgevoerd. Als alternatief kan de ARNA worden opgeslagen bij -20 ° C.
- ARNA Zuivering
- Alle centrifugations in deze sectie moet worden gedaan bij 10.000 xg (meestal ~ 10000 rpm).
- Voor het begin van de ARNA zuivering verwarm de 10 ml flesje Nuclease-vrij water tot 55 ° C gedurende> 10 minuten.
- Voeg 350 ul van ARNA Binding Buffer aan elk ARNA monster. Meng goed door zachte vortexen, en meteen doorgaan naar de volgende stap.
- Voeg 250 ul van ACS kwaliteit 100% EtOH aan elk ARNA monster en meng door pipetteren het mengsel op en neer 3 keer. Geen vortex te mengen. Ga meteen naar de volgende stap, zodra je de EtOH in elk monster, gemengd.
- Plaats een ARNA filter in een ARNA Collection Tube, en pipetteer elk monster mengsel op het midden van het filter in de ARNA Filter Cartridge.
- Centrifuge voor ~ 1 min. bij 10.000 x g. Ga door totdat het mengsel is gepasseerd door het filter. Gooi de doorstroom en vervang de ARNA filterpatroon in de ARNA Collection Tube.
- Van toepassing zijn 650 ul wasbuffer aan elke ARNA Filter Cartridge. Centrifuge voor ~ 1 min bij 10.000 xg, of tot alle wasoplossing wordt door het filter. Gooi de doorstroom en draai de ARNA Filter cartridge voor een extra ~ 1 min tot sporen van EtOH te verwijderen.
- Transfer Filter Cartridge (s) om een nieuwe ARNA Collection Tube. Naar het midden van het filter, voeg 75 ul nuclease-vrij Water dat wordt voorverwarmd tot 50-60 ° C. Plaats de container van Nuclease-vrij water in de 50-60 ° C incubator.
- Laat op kamertemperatuur gedurende 2 minuten en centrifugeer ~ 1,5 min bij 10.000 xg, of tot de oplossing door het filter.
- Herhaal de elutie met een tweede 75 pi van Nuclease-vrij water. Het Arna wordt nu in de ARNA Collection Tube in ~ 150 pi van Nuclease-vrij water. Gooi de ARNA filterpatroon.
- Bewaar ARNA bij -80 ° C en een minimum te beperken herhaald freeze-ontdooien.
Deel 7: cDNA-synthese
Dit deel maakt gebruik van de Promega Universal RiboClone cDNA synthese systeem kit met een lichte wijziging aan de instructies van de fabrikant. Standaard input 2 ug, voor 454 sequencing, is het raadzaam om te beginnen met 10 ug. Als de concentratie te laag is, kan de ARNA worden toegespitst, waarbij zowel EtOH neerslag of vacuüm concentratie. Als 10 microgram wordt gebruikt als RNA-ingang dan de reagentia schaal met een factor van 5De enzymen komen in andere eenheden elke partij, dus volumes moeten worden berekend per keer.
- Eerste Strand Synthese:
- Neem een 0,5 ml PCR tube en voeg toe:
mRNA monster 2 ug (of 10 ug als het gebruikt wordt voor 454 sequencing) Random Hex Primer (0,5 mg / ml) 2 pi Nuclease vrij water om het volume te 0 (of niet is monster werd verdund) Totaal Volume 15 pl - Verwarm de reactie op 70 ° C gedurende 10 minuten. Chill buis op ijs gedurende 5 minuten en spin kort om de oplossing te verzamelen op de bodem van de buis.
- Voeg de volgende onderdelen in de aangegeven volgorde:
Monster 15 pl Eerste Strand 5X Buffer 5 pl RNasin ribonucleaseremmer 40 u 1 pi ... 40 u / ul Totaal Volume 21 pl - Mix reaction en spin kort. Warmte mengsel bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Voeg de volgende onderdelen:
Monster uit stap 1 21,0 ul Natriumpyrofosfaat, 40 mM 2,5 pl AMV Reverse Trancriptase 30 u 1,5 pl ... 22 u / ul Nuclease gratis water 0,0 pl Totaal Volume 25,0 ul - Incubeer reactie voor 1 uur bij 37 ° C in hybridisatie oven.
- Na incubatie plaats reactie op ijs.
- Neem een 0,5 ml PCR tube en voeg toe:
- Tweede-Strand Synthese:
- Voeg de volgende onderdelen:
Eerste-Strand reactie 25,0 ul Tweede Strand 2,5 maal de Buffer 40,0 ul BSA, 1 mg / ml 5,0 pl DNA Polymerase I 23 u 3,0 pl RNase H 0,8 u 0,5 pl ... 1,5 u / ul Nuclease gratis water 26,5 ul Totaal Volume 100,0 ul - Meng voorzichtig door de knop de buis. Incubeer de reacties bij 14 ° C gedurende 2 uur in een thermocycler. Het is belangrijk om de thermocycler afkoelen tot 14 ° C voor het toevoegen van de reactie buizen. Laat niet de reactie boven 14 ° C te krijgen voor of tijdens de reactie.
- Tot beëindiging van de reactie, voeg 2 eenheden T4 DNA-polymerase per ug ingang mRNA naar de reactie. Incubeer gedurende 10 minuten bij 14 ° C.
- Stop de reactie door het toevoegen van 10 pi van 500 mM DEPC behandeld EDTA en leg ze op ijs.
- Reinig de cDNA met behulp van een EtOH neerslag of de Promega Wizard DNA-Cleanup-systeem volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar monsters bij -80 ° C. Double-stranded cDNA kan direct worden pyrosequenced op dit punt.
- Voeg de volgende onderdelen:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het onderzoek van genexpressie door natuurlijke microbiële gemeenschappen is gemeengoed geworden in de afgelopen jaren als een middel om de ecologische rollen en functies van micro-organismen te verkennen. Gebruikt in combinatie met de detectie, kwantificering en karakterisering van mariene micro-organismen, kunnen analyses van genexpressie worden gebruikt om de fylogenie koppelen aan de functie in natuurlijke microbiële gemeenschappen. Veel technieken voor het richten van de functionele expressie van genen zich op specifieke probes of primer sets ontworpen voor genen van bekende sequentie. In tegenstelling, kan het milieu transcriptomics worden gebruikt om de genexpressie te onderzoeken zonder beperkingen die worden opgelegd door bestaande sequence data en met een voorkeur voor die genen actief geuit. Analyse van het mRNA zwembad in de omgeving kan daardoor een van de meest effectieve manieren te ontdekken verbindingen tussen de belangrijkste activiteiten en de organismen die ze bemiddelen.
De eerste toepassing van het milieu transcriptomics op voorwaarde dat een van de eerste standpunten van de samenstelling en dynamiek van de bacteriële mRNA zwembad in een natuurlijk ecosysteem 3. Analyse van de uitgedrukte genen in transcript bibliotheken van zowel een kust kwelder (Sapelo Island, Georgië) en een alkaline, hypersaline meer (Mono Lake CA) onthulde gen sequenties van biogeochemische belang, met inbegrip van milieu varianten van een aantal functionele genen, zoals chitinasen en zwavel oxidatie genen die specifiek waren voor elk van deze ecosystemen. Ook bewijs geleverd voor nieuwe, onverwachte processen zoals de microbiële afbraak van vasculaire plant-en algen-afgeleide polyaminen als een mogelijke koolstof en stikstof bronnen.
Als moleculaire technieken ontwikkelen om de beperkingen in verband met het werken met RNA van milieu monsters en sequencing technologieën te verbeteren te verminderen, is het milieu transcriptomics uitgegroeid tot een meer algemeen gebruikte techniek. Het is gebruikt om de functies van micro-organismen in het oppervlaktewater oceaan 6 te onderzoeken en dag en nacht de functionele expressie van genen te vergelijken binnen dezelfde omgeving 7. Milieu-transcriptomics kan ook gebruikt worden voor het verkrijgen van een beter begrip van microbiële reacties op specifieke milieu-factoren en biogeochemie. Genen of functies ontdekt met behulp van deze techniek kan dienen als doelen voor meer kwantitatieve studies van de genexpressie, zoals microarrays en kwantitatieve PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De financiering werd verstrekt door The Gordon en Betty Moore Foundation subsidies en de National Science Foundation te verlenen MCB-0702125.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | Qiagen | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre Biotechnologies | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega Corp. | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega Corp. | A7280 |
References
- Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
