Summary
Wir stellen eine Methode zur Erzeugung von cDNA aus Umwelt-mRNA. In der Regel Gesamt-RNA zunächst aus der Umgebung gesammelt, rRNA selektiv entfernt, mRNA wird selektiv verstärkt und cDNA aus der angereicherten mRNA-Pool synthetisiert wird sequenziert. Recovered Sequenzen annotiert werden unter Verwendung von Standard Bioinformatik Techniken, um die exprimierten Gene zu identifizieren.
Abstract
Analog zu Metagenomik, Umwelt Transkriptomik (metatranscriptomics) abruft und Sequenzen Umwelt mRNAs aus einer mikrobiellen Assemblage ohne vorherige Kenntnis, welche Gene die Gemeinde könnte zum Ausdruck. So bietet die unvoreingenommene Sicht auf Gemeinschaft Genexpression
Protocol
Arbeiten mit RNA
Da RNasen sind allgegenwärtig und mRNAs abgebaut schnell, Standard-Vorsichtsmaßnahmen für die Arbeit in einer Ribonuklease-freie Umgebung zu beachten und Proben sollten verarbeitet oder konserviert werden so bald wie möglich nach der Entnahme.
Teil 1: Environmental RNA Collection (entworfen, um Biomasse in der 0,2 bis 3,0 mu m Kornfraktion sammeln)
Zubehör benötigt:
Masterflex-Schlauch
Schlauchpumpen
3 mu m hohes Volumen plissiert Kapsel-Filter
0,22 um Supor oder Polycarbonat 142 mm-Filter
142 mm-Filter Turm (Geotech Environmental Equipment)
10-20 l Glasballon (Diplom)
Whirl Packs
Flüssiger Stickstoff
RLT-Puffer (Qiagen)
Beta-Mercaptoethanol
Setup:
Reinigen Handschuhe tragen, wenn der Handhabung der Filter oder jede Berührung der inneren Bauteile des Filters Linie. Pinzetten sollten in sauberen, 50 ml konische Röhrchen, vorzugsweise mit Ethanol gefüllt gehalten werden. Um zu verhindern, große Veränderungen in der Niederschrift Pool, halten Filterung und Handhabung der Proben so kurz wie möglich.
Platzieren Sie ein Ende des Schlauches in das Wasser in der gewünschten Tiefe für die Probenahme. Am entgegengesetzten Ende, schließen Sie das hohe Volumen 3 mu m-Filter. Verbinden Sie die 3 um-Filter, um die 0,22 um Filter Turm. Direkte den Abfluss aus dem 0,22 um in eine graduierte Glasballon.
Vorgehensweise:
- Führen Sie mehrere Liter Wasser durch das System (keine 0,22 um Filter) zu spülen. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie den Schlauch aus dem Wasser, während die Pumpe läuft, um das restliche Wasser aus der Leitung zu spülen.
- Mit einer Pinzette, legen Sie einen 0,22 um Filter auf den Filter Turm und schließen.
- Das Ende der Linie zurück ins Wasser, und schalten Sie die Pumpe. Purge die Luft sowohl aus dem Filter. Monitor das Volumen des Wassers mit der Promotion auf dem Kanister gefiltert.
- Wenn die gewünschte Lautstärke gefiltert wurde, entfernen Sie die Zeile aus dem Wasser und spülen Sie das restliche Wasser aus dem System.
- Sobald der Filter trocken ist, schnell entfernen Sie die obere Filterplatte und falten Sie den Filter. Setzen Sie die Filter in einen Strudel Pack oder 15 ml Collection Tube mit 2 ml RLT-Puffer mit beta-Mercaptoethanol. Snap Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
Teil 2: Die Gesamt-RNA Extraktion von 0,22 um-Filter
Dieser Teil wird die QIAGEN RNeasy Mini Kit mit Änderungen an den Anweisungen des Herstellers
- Bereiten bead schlagen Rohre durch Zugabe von 8 ml RLT-Puffer (beta-Mercaptoethanol hinzugefügt) zu einem 50 ml konischen Rohr. Fügen Sie 1-2 ml RNA Perlen aus einem MOBIO Powersoil Extraktions-Kits
- Schnelles Entfernen des gefrorenen Filter aus dem Gefrierschrank und halten es in den Strudel packen, zerbrechen sie mit einem Holzhammer. Alternativ schneiden Sie die Filter in kleine Stücke in der Sammlung Rohr (15ml) in eine sterile Rasierklinge und fügen Sie alle auf die vorbereitete Rohr (50ml).
- Fügen Sie die zerschmetterte Filter auf die vorbereitete Rohr (50ml) und Dichtung des Rohres Deckel mit Parafilm oder Labor-Band.
- Vortex für 10 Minuten bei Höchstgeschwindigkeit mit einem Vortexer mit einer Anlage für 50 ml Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die 50 ml Tube bei 5000 rpm für 1 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie so viel wie möglich aus dem Lysat und überträgt es auf eine 15 ml Tube.
- Zentrifugieren Sie die 15 ml Tube für 5 min bei 5000 x g.
- Überstand (~ 7 ml) in ein neues 50 ml Tube.
- Fügen Sie 1 Volumen (~ 7 ml) von 100% EtOH zum Lysat.
- Mit einer 30 ml Spritze, die in der 50 ml Tube passt, ziehen Sie das Lysat bis durch einen 18-21 Gauge-Nadel und geben es wieder aus ~ 5 mal. Wenn Sie fertig sind, lassen Sie das Lysat in die Spritze.
- Fahren Sie mit der Extraktion mit dem QIAGEN RNeasy Mini Kit. Es ist hilfreich, um eine Vakuumkammer hier zu verwenden, da das Lysat Volumen (~ 14ml) wesentlich höher ist als das Original-Kit-Protokoll (0,7 ml). Alternativ kann das Lysat durch durch Zugabe von 700 ul an die Säule, Zentrifugieren, und wiederholen, bis alle das Lysat auf die Säule aufgetragen gezogen werden.
- Legen Sie eine Spin-Säule auf der Vakuumkammer und anwenden 700 ul der Probe. Bewerben Unterdruck an den Verteiler auf Inanspruchnahme des Lysats. Fügen Sie weitere Lysat aus der Spritze, bis alle es auf die Spalte angewendet.
- Add 700 ul Puffer RW1 auf die Säule und ziehen sich mit Unterdruck.
- Add 500 ul Puffer RPE auf die Säule und ziehen sich mit Unterdruck.
- Fügen Sie ein zweites Aliquot von 500 ul Puffer RPE auf die Säule und ziehen sich mit Unterdruck.
- Nach der Wäsche wurde komplett durch gezogen, entfernen Sie die Spalte und in ein Sammelrohr.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 1 min bei 8000 x g. Durchfluss verwerfen.
- Centrifuge weitere 2 min bei 8000 xg, um loszuwerden, die EtOH.
- Transfer-Säule in ein neues 2 ml colLection Röhre. Pipette 35 ul RNase-freies Wasser direkt auf die Membran. Schließen Rohr und stehen lassen für 1 min.
- Säule für 2 min bei 8000 x g.
- Quantifizierung der Gesamt-RNA spektrophotometrisch.
Teil 3. DNAse Behandlung
Dieser Teil wird die Ambion TURBO DNA-free-Kit nach den Anweisungen des Herstellers
- Add 3,4 ul 10x DNase I Puffer und 1μl rDNase ich die RNA-Probe.
- Bei 37 º C für 30min.
- Vortex die DNase Inaktivierung Reagenz und fügen 3,4 ul der Inaktivierung Reagenz zur Probe.
- Inkubieren 2 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Mischen.
- Spin bei 10.000 xg für 1,5 min bei Raumtemperatur, dann überweisen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. Vermeiden Sie die Einführung der Inaktivierung Reagenz an die frische Rohr.
Teil 4. Erste rRNA Entfernung
Dieser Teil wird die Epicentre mRNA-ONLY-Kit nach den Anweisungen des Herstellers
- Vorsichtig mischen und kurz zentrifugieren der mRNA-ONLY 10X Reaction Buffer vor dem Gebrauch.
- In einer sterilen (RNase-frei) 0,5 ml-Tube, kombinieren Sie die folgenden Reaktionskomponenten auf Eis:
mRNA-ONLY 10X Reaktionspuffer 2,0 ul RNase-Inhibitor 0,5 ul RNA-Probe (200 ng-10 pg) 16,5 ul Terminator Exonuklease (1 Unit) 1,0 ul Gesamtvolumen 20,0 ul - Inkubieren der Reaktion bei 30 ° C für 60 min in einem Thermocycler (mit beheiztem Deckel) oder im Wasserbad.
- Beenden Sie die Reaktion mit Phenol / EtOH Niederschlag:
- Add RNase-freies H2O auf ein Gesamtvolumen von 200 pl (= 180 ul).
- Auszug: Phenol: Chloroform (1:1), 1 Volumen (= 200 ul). Vortex kräftig und dann drehen 2-5 min auf Hochtouren.
- Entfernen wässrigen Phase (~ 200 ul).
- Add 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat (20 ul) + 2,5 Volumen 100% eiskaltes EtOH (500 ul)
- Inkubieren bei -80 º C für 15-30 min.
- Pellet bei 4 º C, Höchstgeschwindigkeit, 30 min; beachten Sie die Position des Rohres für den späteren Anspruch der Probe (Pellet kann schwierig sein, zu sehen).
- Überstand mit Aspirator oder Pipette.
- Wash mit 500 ul 70% igem eiskaltem EtOH. Resuspendieren durch Vortexen.
- Zentrifuge für 10 min bei Höchstgeschwindigkeit. Überstand.
- Centrifuge restliche Flüssigkeit im Rohr wieder 10 min auf Hochtouren.
- Flüssigkeitsaufnahme sorgfältig und trockene Pellet vollständig, indem sie ihn für ~ 10 min unter der Haube zu öffnen.
- Resuspendieren in 15-20 ul RNase-freies H2O (maximale Eingangsspannung Volumen von MICROBExpress ist 15 ul), lassen Sie es für 5 min bei Raumtemperatur stehen gelassen.
- Verwenden Sie Bioanalyzer oder Experion für rRNA Kontamination und die Qualität der mRNA in diesem Schritt zu überprüfen.
- Das stellt ein mögliches Haltepunkt. RNA kann bei -80 º C Lagerung gelagert werden.
Teil 5. Zweite rRNA Entfernung
Dieser Teil wird die Ambion MICROBEnrich und MICROBExpress Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers. Beide Kits können mehrfach verwendet werden, um die Effizienz der eukaryotischen (MICROBEnrich) und prokaryotische (MICROBExpress) rRNA Entfernung zu erhöhen. Die Eingabe von Gesamt-RNA sollte zwischen 2-10 ug. Das Volumen der RNA sollte weniger als 15 ul werden. So ist das ideale Eingabegerät> 150 ng / ul. -
MICROBEnrich
- Pipette 300 ul Bindungspuffer in ein 1,5 ml Tube
- Add 5-100 pg Gesamt-RNA in einem maximalen Volumen von 30μl und vortexen
- Add 2 ul von Capture Oligo Mix für 5 ug RNA in Bindungspuffer. Tippen Sie auf Rohr vorsichtig und kurz-Spin-Down der Mischung.
- Denaturieren Mischung bei 70 ° C für 10 min
- Glühen der Mischung bei 37 ° C für 1 Stunde. Bereiten Sie die Perlen während dieser Inkubationszeit.
- Bereiten Oligo MagBeads (in der Regel 25 ul) von einmaligem Waschen in Nuklease-freies Wasser und einmal in Bindungspuffer, der Erfassung der Perlen auf einer magnetischen stehen zwischen Wäschen. Bewahren Sie die Perlen auf dem Eis. Warm sie bis auf Raumtemperatur 5 min vor dem Gebrauch.
- Erhitzen Sie die Waschlösung auf 37 ° C in der Hitze zu blockieren.
- Fügen Sie die RNA / capture Oligo Mix zu den gewaschenen Oligo MagBeads. Sehr vorsichtig mischen die Röhre und Spin kurz.
- Inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C für 15 min.
- Das Röhrchen wird in das Magnetfeld stehen und warten, ~ 3 min.
- Saugen Sie den Überstand (enthält mRNA) und überträgt es auf eine Sammlung Röhrchen auf Eis.
- 100 l vorgewärmtes Waschlösung erfasst Perlen. Vorsichtig vortexen Perlen kurz. Capture-Perlen und erholen Überstand. Pool dieser Überstand mit mRNA in das Sammelrohr auf Eis (~ 450 ul Endvolumen).
- Legen Sie die Sammelröhrchen auf Eis. Wenn eine zweite Runde ausgeführt werden soll, wieder auf 5,3 go) Abschnitt und wiederholen Sie den Vorgang. Alternativ sofortiger Wechsel in die MICROBExpress Kit (5,18, siehe unten).
- Gebrauchte OlioBeads kann ein zweites Mal verwendet werden. Generieren Sie die Oligobeads durch Inkubation mit 2 Bänden (in der Regel 50 ul) der Regeneration Lösung 1 für 1 Stunde. Capture the Perlen in einem Magnetfeld stehen. Waschen Sie sie zweimal mit 2 Volumina Regeneration Lösung 2 (in der Regel 50 ul) und resuspendieren sie in ihrem ursprünglichen Volumen von Resuspension Lösung (in der Regel 25 ul).
MICROBExpress - Je 200 ul Bindungspuffer in ein 1,5 ml Tube.
- Add 2-10 pg Gesamt-RNA in einem maximalen Volumen von 15μl und vortexen.
- Add 4 ul von Capture Oligo Mix der RNA in Bindungspuffer. Tippen Sie auf Rohr vorsichtig und kurz-Spin-Down der Mischung.
- Denaturieren Mischung bei 70 ° C für 10 min.
- Glühen Mischung bei 37 ° C für 15 min Perlen Bereiten Sie während dieser Inkubation.
- Bereiten Oligo MagBeads durch Waschen einmal in Nuklease-freies Wasser, gefolgt von zwei Waschungen in 50 ul Bindungspuffer, der Erfassung der Perlen auf einer magnetischen stehen zwischen Wäschen. Resuspendieren Perlen in 50 ul Bindungspuffer und bei 37 ° C bis zur Verwendung.
- Erhitzen Sie die Waschlösung auf 37 ° C in Heizblock
- Vortex gewaschen Oligo MagBeads sanft. Dann werden 50 ul Oligo MagBeads auf RNA / capture Oligo Mix. Sehr vorsichtig mischen die Röhre und Spin kurz.
- Inkubieren Mischung bei 37 ° C für 15 min.
- Das Röhrchen wird in das Magnetfeld stehen und warten, ~ 3 min.
- Saugen Sie den Überstand (enthält mRNA) und überträgt es auf eine Sammlung Röhrchen auf Eis.
- 100 l vorgewärmtes Waschlösung erfasst Perlen. Vorsichtig vortexen Perlen kurz.
- Capture-Perlen und erholen Überstand. Pool dieser Überstand mit mRNA in das Sammelrohr auf Eis (~ 350 ul Endvolumen).
- Wenn eine zweite Runde ausgeführt werden soll, gehen Sie zurück zu Abschnitt 5.18) und den Vorgang wiederholen. Alternativ sofort mit Niederschlag mRNA.
- Niederschlag und resuspendieren mRNA:
- Um den gepoolten mRNA add 35 ul Natriumacetat und fügen Sie 7 ul Glykogen.
- Add 1175 ul eiskaltem 100% EtOH und gründlich vortexen.
- Niederschlag bei -20 ° C für mindestens 1 Stunde.
- Zentrifuge für 30 min bei 10.000 x g.
- Vorsichtig dekantieren und den Überstand verwerfen.
- Add 750 ul eiskaltem 70% EtOH und kurz vortexen.
- Zentrifugieren Sie für 5 min bei 10.000 xg und Überstand verwerfen.
- Haben ein zweites 70% EtOH waschen.
- Kurz Respin das Rohr nach dem Ablegen der zweiten 70% EtOH waschen.
- Entfernen Sie vorsichtig Überstand mit einer Pipette.
- An der Luft trocknen Pellet für 5 min.
- Die RNA Pellet in 25 ul TE-Puffer oder RNase freiem Wasser
- Rehydrieren RNA für 15 min bei Raumtemperatur.
- Vortex die Probe kräftig, wenn nötig.
- Wenn es notwendig ist, entfernen Sie restlichen Perlen, Platz Rohr auf magnetischen stehen für ~ 3min und bewegen bereichert mRNA neue RNase freie Röhre.
- Verwenden Sie Bioanalyzer oder Experion für rRNA Kontamination und die Qualität der mRNA in diesem Schritt zu überprüfen.
- Das stellt ein mögliches Haltepunkt. RNA kann bei -80 º C Lagerung gelagert werden.
Teil 6: mRNA-Amplifikation
Dieser Teil wird die Ambion MessageAmp II-Bakterien Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Berechnen Mastermixen online unter www.ambion.com/tools/ma2bact .
- Polyadenylierung Template-RNA:
- Legen Sie bis zu 1000 ng Gesamt-RNA (typischerweise 100-500 ng) bzw. bis zu 500 ng mRNA (in der Regel 10 ng-200 ng) in ein steriles RNase-free Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie 6,5 ul Probe und keine RNase freies Wasser in den ersten Puffer.
- Inkubieren 10 min bei 70 ° C, vorzugsweise in einem Thermocycler.
- Entfernen Sie die RNA-Proben aus dem 70 ° C Inkubator und kurz zentrifugieren (~ 5 s) zur Probe am Boden des Röhrchens zu sammeln. Legen Sie die Mischung auf Eis für 3 min.
- Bereiten Polyadenylierung Master Mix in einem Nuklease-freies Röhrchen bei Raumtemperatur in der Reihenfolge auf die Berechnung Blatt gezeigt. Montieren Sie genug Mastermix für alle Proben in dem Versuch, darunter ≤ 5% Überschuss an Pipettierfehler decken. Gently Wirbel um eine homogene Mischung ohne Inaktivierung des Enzyms zu machen, dann für ca. 5 s Zentrifuge an den Master-Mix am unteren Rand des Röhrchens zu sammeln.
- Übertragen 3,5 ul der Polyadenylierung Master Mix zu jeder RNA-Probe, mischen durch vorsichtiges Vortexen und folgen mit einer schnellen Spin, um die Reaktion zu sammeln.
- Legen Sie die Proben in einem 37 ° C Inkubator. Inkubieren Reaktionen für 15 minbei 37 ° C, dann kurz zentrifugieren, um die Reaktion auf den Boden des Röhrchens zu sammeln.
- Nach dem 37 ° C inkubiert, legen Sie die Reaktionen auf Eis und gehen sofort an die Reverse Transkription.
- Reverse Transkription zu synthetisieren First Strand cDNA:
- Bereiten Reverse Transkription Master Mix in einem Nuklease-freies Röhrchen bei Raumtemperatur in der Reihenfolge auf die Berechnung Blatt gezeigt. Montieren Sie genug Mastermix für alle Proben in dem Versuch, darunter ≤ 5% Überschuss an Pipettierfehler decken. Gently Wirbel um eine homogene Mischung ohne Inaktivierung des Enzyms zu machen, dann für ca. 5 s Zentrifuge an den Master-Mix am unteren Rand des Röhrchens zu sammeln.
- Transfer 10 ul der reversen Transkription Master Mix zu jeder Probe, mischen Sie durch leichtes Vortexen, und folgen Sie mit einer schnellen Spin, um die Reaktion zu sammeln.
- Legen Sie die Proben in einem 42 ° C Inkubator. Inkubieren für 2 h bei 42 ° C, dann kurz zentrifugieren (~ 5 s), um die Reaktion am Boden des Röhrchens zu sammeln.
- Die Röhrchen auf Eis und sofort auf den zweiten cDNA-Synthese vor.
- Zweite cDNA-Synthese:
- Auf Eis, bereiten Sie einen zweiten Strang Master Mix durch Mischen der folgenden Reagenzien in der Reihenfolge, in der Berechnung Blatt gezeigt. Montieren Sie genug Mastermix für alle Proben in dem Versuch, darunter ≤ 5% Überschuss an Pipettierfehler decken. Gently Wirbel um eine homogene Mischung ohne Inaktivierung der Enzyme zu machen, dann für ca. 5 s Zentrifuge an den Master-Mix am unteren Rand des Röhrchens zu sammeln.
- Transfer-80 ul zweiten Strang Master Mix zu jeder Probe, mischen Sie durch leichtes Vortexen, und folgen Sie mit einer schnellen Spin, um die Reaktion zu sammeln.
- Legen Sie die Proben in einem 16 ° C Thermocycler. Es ist wichtig, den Thermocycler-Block auf 16 ° C vor der Zugabe der Reaktionsgefäße, weil Aussetzen der Reaktionen auf Temperaturen> 16 ° C wird aRNA Ertrag Kompromiss cool.
- Inkubieren 2 h bei 16 ° C inkubieren 2 h in einem 16 ° C Thermocycler. Wenn der Deckel Temperatur nicht eingestellt werden, um die 16 ° C Blocktemperatur angepasst werden, decken die Reaktionen mit den Heizdeckel ausgeschaltet ist, oder wenn der Deckel kann nicht ausgeschaltet werden, decken nicht die Rohre mit ihm.
- Legen Sie Reaktionen auf Eis kurz. Lassen Sie die Reaktionen auf Eis für lange Zeiträume.
- 5,4) cDNA Reinigung:
- Alle Zentrifugationen in diesem Reinigungsverfahren sollte bei 10.000 xg (typischerweise ~ 10.000 rpm) bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Überprüfen Sie die cDNA Binding Buffer für Niederschlag, bevor es zu benutzen. Wenn ein Niederschlag sichtbar ist, wird diese erneut durch Erwärmen der Lösung auf 37 ° C für bis zu 10 min und Vortex kräftig. Abkühlen auf Raumtemperatur vor Gebrauch.
- Vor Beginn der cDNA Reinigung, Vorwärmung der 10 ml Flasche Nuklease-freiem Wasser auf 50 ° C für mindestens 10 min.
- Add 250 ul cDNA Binding Buffer zu jeder Probe und mischen Sie gründlich durch sanftes Vortexen.
- Zentrifuge für ca. 1 min bei 10.000 g, oder bis die Mischung durch den Filter. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und ersetzen Sie die cDNA-Filtereinsatz in der Wäsche Röhre.
- Apply 500 ul Waschpuffer in jede cDNA-Filtereinsatz. Zentrifuge für ca. 1 min bei 10.000 g, oder bis alle Waschpuffer wird durch den Filter. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und drehen Sie das cDNA-Filtereinsatz für eine weitere Minute auf Spuren von EtOH zu entfernen.
- Transfer-cDNA-Filtereinsatz zu einer cDNA Elution Tube. Eluieren mit 20 ul von 50 ° C Nuklease-freies Wasser cDNA. Es ist wichtig, Nuklease-freies Wasser, das bei 50 ° C für die cDNA Elution verwenden. Kälteres Wasser wird weniger effizient bei der Elution der cDNA, und heißer Wasser (> 55 ° C) kann in reduzierter aRNA Ertrag führen.
- Um die Mitte des Filters in der cDNA-Filter-Kartusche, gelten 20 ul vorgewärmte (50 ° C) Nuklease-freies Wasser. Lassen Sie bei Raumtemperatur für 2 min und dann Zentrifuge für ~ 1,5 min bei 10.000 xg, oder bis alle Nuklease-freies Wasser durch den Filter. Die doppelsträngigen cDNA wird nun im Eluat (~ 16 ul) werden.
- Das gereinigte cDNA über Nacht bei -80 ° C an dieser Stelle gespeichert werden, falls gewünscht.
- In vitro-Transkription zu synthetisieren aRNA
- Es wird empfohlen, einem Hybridisierungsofen aufgrund ihrer gleichmäßigen Temperatur zu verwenden, und weil es extrem wichtig, dass keine Kondensation in den Rohren bilden. Wir empfehlen eine 14 h IVT Reaktion Inkubation zu aRNA Ausbeute zu maximieren. Für höchste aRNA Ertrag, führen die IVT in einem 40 ul Endreaktionsvolumen.
- Bei Raumtemperatur, montieren einer IVT Master Mix durch Zugabe von Reagenzien in der Reihenfolge auf die Berechnung Blatt aufgelistet. Gut mischen durch vorsichtiges Vortexen. Kurz zentrifugieren (~ 5 s) zum ColLect der IVT Master Mix am unteren Rand des Rohres und auf Eis stellen.
- Transfer IVT Master Mix zu jeder Probe nach den Richtlinien des Blatts zur Berechnung Mischung durch leichtes Vortexen, kurz zentrifugieren, um die Reaktion zu sammeln, und legen Sie die Röhrchen in einem 37 ° C Inkubator.
- Inkubieren für 14 h bei 37 ° C.
- Nach der Inkubationszeit, fügen Nuklease-freies Wasser zu jeder aRNA Probe auf das Endvolumen auf 100 ul zu bringen. Mix durch leichtes Vortexen. Legen Sie die verdünnte aRNA auf Eis, wenn die aRNA Reinigungsschritt sofort erledigt werden. Alternativ kann die aRNA bei -20 ° C gelagert werden
- aRNA Purification
- Alle Zentrifugationen in diesem Abschnitt sollten bei 10.000 xg (typischerweise ~ 10.000 rpm) durchgeführt werden.
- Vor Beginn der Reinigung aRNA Vorwärmung der 10 ml Flasche Nuklease-freiem Wasser auf 55 ° C für> 10 min.
- Add 350 ul aRNA Binding Buffer für jeden aRNA Probe. Mix durch leichtes Vortexen, und gehen Sie zum nächsten Schritt sofort.
- Add 250 ul ACS grade 100% EtOH jedem aRNA Probe und mischen Sie mit einer Pipette das Gemisch nach oben und unten 3 mal. Nicht vortexen zu mischen. Gehen Sie sofort zum nächsten Schritt, sobald Sie die EtOH in jeder Probe gemischt.
- Ein aRNA Filterpatrone in einem aRNA Collection Tube und Pipette jede Probe Mischung auf die Mitte des Filters in die aRNA Filterpatrone.
- Zentrifuge für ca. 1 min bei 10.000 x g. Weiter, bis die Mischung durch den Filter passiert hat. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und ersetzen Sie die aRNA Filterpatrone im aRNA Collection Tube.
- Apply 650 ul Waschpuffer in jede aRNA Filterpatrone. Zentrifuge für ca. 1 min bei 10.000 xg, oder bis alle Waschlösung wird durch den Filter. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und drehen Sie das aRNA Filterpatrone für einen zusätzlichen ~ 1 min auf Spuren von EtOH zu entfernen.
- Transfer-Filter Cartridge (s) in ein frisches aRNA Collection Tube. Um die Mitte des Filters, fügen Sie 75 ul Nuklease-freies Wasser, das auf 50-60 ° C vorgewärmt wird Ersetzen Sie den Behälter mit Nuklease-freies Wasser in die 50-60 ° C Inkubator.
- Lassen Sie bei Raumtemperatur für 2 min und dann Zentrifuge für ~ 1,5 min bei 10.000 xg, oder bis die Lösung durch den Filter.
- Wiederholen Sie die Elution mit einem zweiten 75 ul Nuklease-freies Wasser. Die aRNA wird nun in der aRNA Collection Tube in ~ 150 ul Nuklease-freies Wasser sein. Entsorgen Sie die aRNA Filterpatrone.
- Shop aRNA bei -80 ° C und minimieren wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
Teil 7: cDNA-Synthese
Dieser Teil wird die Promega Universal-RiboClone cDNA Synthesis System-Kit mit leichten Veränderungen, die Anweisungen des Herstellers. Standard-Eingang 2 ug; für 454 Sequencing, empfiehlt es sich, mit 10 ug beginnen. Wenn die Konzentration zu gering ist, kann die aRNA entweder mit EtOH Fällung oder Vakuum-Konzentration konzentriert werden. Wenn 10 ug RNA als Eingang verwendet wird dann skalieren alle Reagenzien bis um den Faktor 5Die Enzymen in Einheiten verschiedener jede Charge stammen, also Bände berechnet jedes Mal sein.
- First Strand Synthesis:
- Nehmen Sie ein 0,5 ml PCR-Röhrchen und fügen:
mRNA Probe 2 pg (oder 10 ug, wenn für die 454 Sequencing verwendet) Zufällige Hex Primer (0,5 mg / ml) 2 ul Nuclease freies Wasser, um die Lautstärke 0 (oder nicht ist Probe wurde verdünnt) Gesamtvolumen 15 ul - Die Reaktion wird auf 70 ° C für 10 min. Chill-Röhrchen auf Eis für 5 min und Spin kurz auf die Lösung am Boden des Röhrchens zu sammeln.
- Fügen Sie die folgenden Komponenten in der angegebenen Reihenfolge:
Probe 15 ul First Strand Buffer 5X 5 pl RNasin Ribonucleaseinhibitor 40 u 1 ul ... 40 u / ul Gesamtvolumen 21 ul - Mix reaction und Spin kurz. Wärme-Gemisch bei 37 ° C für 5 min.
- Fügen Sie die folgenden Komponenten:
Beispiel aus Schritt 1 21,0 ul Natriumpyrophosphat, 40 mM 2,5 ul AMV Reverse-Trancriptase 30 u 1,5 ul ... 22 U / ul Nuclease freies Wasser 0,0 ul Gesamtvolumen 25,0 ul - Inkubieren Reaktion für 1 h bei 37 ° C in Hybridisierungsofen.
- Nach der Inkubation statt Reaktion auf Eis.
- Nehmen Sie ein 0,5 ml PCR-Röhrchen und fügen:
- Second-Strand Synthesis:
- Fügen Sie die folgenden Komponenten:
First-Strand Reaktion 25,0 ul Zweite Strand 2.5X Buffer 40,0 ul BSA, 1 mg / ml 5,0 ul DNA-Polymerase I 23 u 3,0 ul RNase H 0,8 U 0,5 ul ... 1,5 U / ul Nuclease freies Wasser 26,5 ul Gesamtvolumen 100,0 ul - Vorsichtig mischen durch flicking die Röhre. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 14 ° C für 2 h in einem Thermocycler. Es ist wichtig, den Thermocycler auf 14 ° C abkühlen, bevor Sie die Reaktionsgefäße. Lassen Sie sich nicht die Reaktion über 14 ° C zu bekommen, bevor oder während der Reaktion.
- Zur Beendigung der Reaktion, fügen Sie 2 Einheiten T4 DNA Polymerase pro pg Eingang mRNA, um die Reaktion. Inkubieren für 10 min bei 14 ° C.
- Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 10 pl 500 mM DEPC behandelt EDTA und auf Eis stellen.
- Reinigen Sie die cDNA entweder mit einem EtOH Fällung oder der Promega Wizard DNA-Cleanup-System nach den Anweisungen des Herstellers. Shop-Proben bei -80 ° C. Doppelsträngigen cDNA kann direkt an dieser Stelle pyrosequenced werden.
- Fügen Sie die folgenden Komponenten:
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Discussion
Die Untersuchung der Genexpression durch natürliche mikrobielle Gemeinschaften hat sich in den letzten Jahren häufig als Mittel, um die ökologische Rolle und Funktion von Mikroorganismen zu entdecken. In Kombination mit dem Nachweis, Quantifizierung und Charakterisierung von marinen Mikroorganismen, können Analysen der Genexpression verwendet werden, um Phylogenie Link in natürlicher mikrobieller Gemeinschaften funktionieren. Viele Techniken der gezielten funktionellen Genexpression beruhen auf spezifischen Sonden oder Primer-Sets für Gene mit bekannter Sequenz bestimmt. Im Gegensatz dazu kann die Umwelt Transkriptomik zur Genexpression, ohne Einschränkungen durch bestehende Sequenz-Daten und mit Vorliebe für jene Gene aktiv ausgedrückt auferlegt zu untersuchen. Die Analyse der mRNA-Pool in der Umwelt können daher eine der effektivsten Möglichkeiten zu entdecken, Verbindungen zwischen den wichtigsten Aktivitäten und die Organismen, die sie vermitteln.
Die erstmalige Anwendung von Umwelt-Transkriptomik sofern einer der ersten Ausblick auf die Zusammensetzung und Dynamik der bakteriellen mRNA-Pool in einem natürlichen Ökosystem 3. Die Analyse der exprimierten Gene in Abschrift Bibliotheken sowohl in Küsten-Salzwiesen (Sapelo Island, GA) und einer alkalischen, hypersaline See (Mono Lake CA) zeigte Gensequenzen von biogeochemischen Interesse, einschließlich Umwelt-Varianten mehrere funktionelle Gene, wie Chitinasen und Schwefel Oxidation Genen, die spezifisch für jede dieser Ökosysteme wurden. Darüber hinaus legte Beweise für neue, unerwartete Prozesse wie die mikrobiellen Abbau von Gefäßpflanzen-und Algen-derived Polyaminen als eine mögliche Kohlenstoff-und Stickstoff-Quellen.
Als molekulare Techniken zu entwickeln, um die Einschränkungen beim Arbeiten mit RNA aus Umweltproben und Sequenzierung Technologien verbessern zu verringern, hat die Umwelt Transkriptomik zu einem mehr weit verbreitete Technik. Es wurde verwendet, um die Funktionen der Mikroorganismen in der Oberfläche Ocean 6 zu untersuchen und Tag und Nacht funktionellen Genexpression in der gleichen Umgebung 7 vergleichen. Environmental Transkriptomik kann auch für ein besseres Verständnis der mikrobiellen Reaktionen auf bestimmte Umweltfaktoren und Biogeochemie verwendet werden. Gene oder Funktionen entdeckt mit Hilfe dieser Technik können als Ziele für die weitere quantitative Untersuchungen der Genexpression wie Microarrays und quantitativer PCR dienen.
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Acknowledgments
Die Finanzierung wurde von der Gordon and Betty Moore Foundation Zuschüsse und der National Science Foundation Grant MCB-0702125 zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | Qiagen | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre Biotechnologies | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega Corp. | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega Corp. | A7280 |
References
- Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
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