Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח ביטוי גנים מקהילות מיקרוביאלית ימית באמצעות Transcriptomics הסביבה

Published: February 18, 2009 doi: 10.3791/1086
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Marine Sciences, University of Georgia (UGA)

Summary

אנו מציגים שיטה להפקת cDNA מ-mRNA הסביבה. באופן כללי, הכולל RNA נאסף הראשון הסביבה, rRNA מוסר סלקטיבי, mRNA מוגבר באופן סלקטיבי, ועל cDNA מסונתז ממאגר mRNA מועשר הוא רצף. רצפים ששוחזרו ניתן להוסיף הערות באמצעות תקן טכניקות ביואינפורמטיקה כדי לזהות את הגנים לידי ביטוי.

Abstract

מקביל metagenomics, transcriptomics סביבתיים (metatranscriptomics) מאחזר רצפים mRNAs סביבתיים מתוך מכלול של חיידקים ללא ידיעה מוקדמת של מה הגנים הקהילה יכול להיות להביע. כך הוא מספק את הפרספקטיבה משוחדת ביותר על ביטוי גנים הקהילה

Protocol

עבודה עם RNA

מכיוון RNases נמצאים בכל מקום ועל mRNAs לבזות במהירות, אמצעי הזהירות תקן עובד בסביבה-ribonuclease חופשית חייבת להיות מלווה דגימות צריך להיות מעובד או משומרים בהקדם האפשרי אוסף הבאים.

חלק 1: הסביבה RNA אוסף (שנועד לאסוף ביומסה בשבריר בגודל 0.2-3.0 מיקרומטר)

ציוד נחוץ:
Masterflex צינורות
Peristaltic משאבה
3 בנפח גבוה מיקרומטר קפלים הקפסולה מסנן
0.22 מיקרומטר Supor או פוליקרבונט 142 מ"מ פילטר
142 מ"מ לסנן מגדל (Geotech הסביבה ציוד)
10-20 L בקבוק (בוגר)
סיחרור חבילות
חנקן נוזלי
RLT חיץ (Qiagen)
בטא mercaptoethanol

ההתקנה:
כפפות נקי יש ללבוש בכל פעם טיפול מסננים או נגיעה כל הרכיבים הפנימיים של הקו הסינון. מלקחיים יש לשמור, לנקות צינורות חרוטי 50 מ"ל, מלא רצוי עם אתנול. כדי למנוע שינויים משמעותיים בבריכה התמליל, לשמור סינון וטיפול מדגם פעמים קצר ככל האפשר.

הנח קצה אחד של הצינור לתוך המים בעומק הרצוי לדגימה. בצד השני, לצרף את נפח גבוה 3 מיקרומטר הסינון. חבר את 3 מיקרומטר לסנן למגדל 0.22 מיקרומטר הסינון. כוונו את יצוא של 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוק בוגר.

נוהל:

  1. הפעל כמה ליטרים של מים באמצעות המערכת (לא לסנן 0.22 מיקרומטר) לשטוף. בסיום, להסיר את צינורות מהמים תוך המשאבה פועלת לטהר את המים שנותרו מן השורה.
  2. בעזרת מלקחיים, במקום 0.22 מיקרומטר לסנן על המגדל קרוב לסנן.
  3. מניחים את הקצה של הקו בחזרה לתוך המים להפעיל את המשאבה. טהר את האוויר משני המסננים. צג את נפח המים המסוננים עם סיום הלימודים על בקבוק.
  4. כאשר נפח הרצוי סוננה, להסיר את קו המים לטהר את המים שנותרו מן המערכת.
  5. ברגע סינון יבש, להסיר במהירות את הצלחת לסנן העליון לקפל את המסנן. הנח את המסנן לתוך חפיסת להסתחרר או 15 מ"ל צינור אוסף המכיל 2 מ"ל של חיץ RLT עם mercaptoethanol בטא. הצמד הקפאה בחנקן נוזלי.

חלק 2: סה"כ מיצוי RNA מן לסנן מיקרומטר 0.22

חלק זה משתמש בערכה RNeasy QIAGEN מיני עם שינויים הוראות היצרן

  1. הכן צינורות מכות חרוז ידי הוספת 8 מ"ל של חיץ RLT (בטא mercaptoethanol נוסף) כדי צינור חרוטי 50 מ"ל. הוסף 1-2 מ"ל של חרוזים RNA מתוך ערכת חילוץ MoBio Powersoil
  2. במהירות להסיר את המסנן קפוא מהמקפיא, שמירה על אותה באריזה להסתחרר, לנפץ אותו עם פטיש. לחלופין, לחתוך את חתיכות קטנות מסננים בצינור האוסף (15 מ"ל) באמצעות סכין גילוח סטרילי ולהוסיף אותו כל הצינור מוכן (50 מ"ל).
  3. הוסף את המסנן התנפצו אל הצינור מוכן (50 מ"ל), ו לאטום את מכסה שפופרת עם parafilm או קלטת המעבדה.
  4. וורטקס במשך 10 דקות בשיא המהירות באמצעות vortexer עם קובץ מצורף עבור 50 צינורות מ"ל.
  5. צנטריפוגה שפופרת 50 מ"ל ב 5000 סל"ד עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. הסר ככל האפשר של lysate ולהעביר אותו צינור 15 מ"ל.
  7. צנטריפוגה שפופרת 15 מ"ל 5 דקות ב 5000 x ז
  8. העברת supernatant (~ 7 מ"ל) לצינור 50 מ"ל חדש.
  9. הוסף 1 נפח (~ 7 מ"ל) של 100% עד EtOH lysate.
  10. בעזרת מזרק 30 מ"ל שמתאימה לתוך שפופרת 50 מ"ל, לצייר את lysate דרך מחט 18-21 מד ולהעביר אותו בחזרה החוצה ~ 5 פעמים. בסיום, לעזוב את lysate בתוך המזרק.
  11. המשך מיצוי עם ערכת RNeasy מיני QIAGEN. זה מועיל להשתמש סעפת ואקום כאן, שכן נפח lysate (~ 14ml) עולה בהרבה על פרוטוקול הערכה המקורית (0.7 מ"ל). לחלופין, lysate ניתן להסיק דרך על ידי הוספת 700 μl לעמודה, centrifuging, וחזרה עד שכל lysate הוחל על הטור.
  12. המקום טור ספין על סעפת ואקום וליישם 700 μl של המדגם. החל הלחץ ואקום סעפת כדי לצייר את lysate. ממשיכים להוסיף lysate מן המזרק עד שכל זה הוחל על הטור.
  13. הוסף 700 μl RW1 חיץ העמודה ולמשוך למטה עם הלחץ ואקום.
  14. הוסף 500 μl הרשתית חיץ העמודה ולמשוך למטה עם הלחץ ואקום.
  15. הוספת aliquot השני של הרשתית 500 חיץ μl לעמודה ולמשוך למטה עם הלחץ ואקום.
  16. לאחר לשטוף נערך לחלוטין דרך, להסיר את העמודה מקום צינור איסוף.
  17. צנטריפוגה צינור 1 דקות ב 8000 x ז בטל זרימה דרך.
  18. צנטריפוגה 2 דקות נוספות ב 8000 XG להיפטר EtOH.
  19. העברת עמודה חדשה 2 מ"ל collection צינור. פיפטה 35 μl מים RNase חופשית ישירות על גבי הממברנה. סגירת הצינור ולתת לעמוד במשך דקות 1.
  20. צנטריפוגה 2 דקות ב 8000 x ז
  21. לכמת את סך spectrophotometrically RNA.

חלק 3. DNAse טיפול

חלק זה משתמש DNA ללא Ambion TURBO קיט על פי הוראות היצרן

  1. הוספת 3.4 μl 10x DNase אני הצפת ו 1μl rDNase אני המדגם RNA.
  2. דגירה ב-C º 37 במשך 30 דקות.
  3. וורטקס מגיב איון DNase ולהוסיף 3.4 μl של מגיב איון המדגם.
  4. דגירה 2 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מדי פעם.
  5. ספין על XG 10.000 1.5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להעביר את supernatant לצינור חדש. הימנע מציגה מגיב איון לתוך הצינור טריים.

חלק 4. הסרת ראשון rRNA

חלק זה משתמש בערכה Epicentre mRNA בלבד לפי הוראות היצרן

  1. בעדינות מערבבים בקצרה בצנטריפוגה הצפת mRNA בלבד תגובת 10X לפני השימוש.
  2. בתוך צינור סטרילי 0.5 (RNase חופשי) מ"ל, לשלב את הרכיבים הבאים תגובה על הקרח:
    mRNA בלבד תגובת 10X הצפת 2.0 μl
    RNase אינהיביטור 0.5 μl
    לדוגמה סך RNA (200 ng-10 מיקרוגרם) Μl 16.5
    Terminator exonuclease (1 יחידה) 1.0 μl
    סך נפח 20.0 μl
  3. דגירה התגובה על 30 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ב thermocycler (מחומם עם מכסה) או אמבט מים.
  4. לסיים את התגובה עם משקעים פנול / EtOH:
    1. הוסף RNase ללא H2O כדי בהיקף כולל של μl 200 (= 180 μl).
    2. תמצית: פנול: כלורופורם (1:1), 1 נפח (= 200 μl). וורטקס נמרצות ואז ספין 2-5 דקות במהירות שיא.
    3. הסר השלב מימית (~ 200 μl).
    4. הוסף 0.1 כרכים של נתרן אצטט M 3 (20 μl) + 2.5 בנפח של 100% קרח קר EtOH (500 μl)
    5. דגירה ב -80 º C במשך 15-30 דקות.
    6. גלולה על 4 מעלות צלזיוס, במהירות שיא, 30 דקות; לציין את המיקום של הצינור על השאיפה מאוחר יותר של המדגם (גלולה יכול להיות קשה לראות).
    7. בטל supernatant עם aspirator או פיפטה.
    8. שטפו עם 500 μl EtOH 70% קרח קר. Resuspend ידי vortexing.
    9. צנטריפוגה במשך 10 דקות בשיא המהירות. בטל supernatant.
    10. צנטריפוגה נוזל הנותר בצינור שוב 10 דקות בשיא המהירות.
    11. לשאוב נוזלים בזהירות גלולה יבש לחלוטין על ידי השארת אותו פתוח 10 דקות ~ מתחת למכסה המנוע.
    12. Resuspend ב 15-20 μl RNase ללא H2O (נפח מרבי של הזנה MICROBExpress הוא 15 μl); ולהשאיר אותו לעמוד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    13. השתמש Bioanalyzer או Experion כדי לבדוק זיהום rRNA ואיכות mRNA בשלב זה.
    14. זוהי נקודת עצירה פוטנציאלי. RNA יכול להיות מאוחסן על אחסון -80 מעלות צלזיוס.

חלק 5. הסרת השנייה rRNA

חלק זה משתמש Ambion MICROBEnrich וערכות MICROBExpress על פי הוראות היצרן. ערכות שניהם ניתן להשתמש מספר פעמים כדי להגביר את היעילות של אוקריוטים (MICROBEnrich) והסרת פרוקריוטים (MICROBExpress) rRNA. הקלט של רנ"א הכל צריך להיות בין 20-10 מיקרוגרם. נפח RNA צריך להיות פחות מ 15 μl. כך, הקלט האידיאלי הוא> 150 ng / μl. -

MICROBEnrich

  1. פיפטה 300 חיץ עקידת μl לתוך צינור 1.5ml
  2. הוסף RNA 500-100 מיקרוגרם סך בנפח מרבי של 30μl ו מערבולת בעדינות
  3. הוסף 2 μl של מיקס לכידת אוליגו עבור 5 מיקרוגרם RNA במאגר הכבילה. גע בעדינות צינורית קצרה ספין מטה את התערובת.
  4. תערובת לפגל על ​​70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות
  5. לחשל את התערובת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הכינו את החרוזים במהלך הדגירה זה.
  6. הכן אוליגו MagBeads (בדרך כלל 25 μl) על ידי שטיפה במים פעם nuclease ללא ופעם חיץ הכבילה, ללכוד את החרוזים על מעמד מגנטי בין שוטף. חנות חרוזים על הקרח. חם להם עד 5 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  7. מחממים את הפתרון לשטוף עד 37 ° C בבלוק חום.
  8. מוסיפים את RNA / ללכוד אוליגו מערבבים את MagBeads שטף אוליגו. בעדינות מערבבים את הצינור ספין בקצרה.
  9. דגירה תמהיל ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  10. מניחים את הצינורית לעמוד המגנטי ולחכות 3 דקות ~.
  11. לשאוב supernatant (מכיל mRNA) ולהעביר אותו צינור איסוף על הקרח.
  12. הוסף 100 μl של פתרון מראש חימם לשטוף את חרוזי בשבי. מערבולת בעדינות את אגלי בקצרה. לכידת חרוזים להתאושש supernatant. בריכה זו supernatant עם mRNA בצינור האוסף על הקרח (~ 450 נפח סוף μl).
  13. מקמו את צינור האיסוף על הקרח. אם בסיבוב השני עומד להתבצע, לחזור 5.3) סעיף לחזור על התהליך. לחלופין, לעבור מיד ערכת MICROBExpress (5.18, ראה להלן).
  14. OlioBeads משומשים ניתן להשתמש פעם נוספת. לחדש את Oligobeads דוגרים על ידי אותם עם 2 כרכים (בדרך כלל 50 μl) הפתרון התחדשות 1 עבור 1 שעה. צלמו את החרוזים לעמוד מגנטי. לשטוף אותם פעמיים עם 2 כרכים של פתרון התחדשות 2 (בדרך כלל 50 μl) ו resuspend להם נפח המקורי של פתרון Resuspension (בדרך כלל 25 μl).
    MICROBExpress
  15. פיפטה 200 חיץ עקידת μl לתוך צינור 1.5ml.
  16. הוסף 20-10 מיקרוגרם RNA סך בנפח מרבי של 15μl ו מערבולת בעדינות.
  17. הוסף 4 μl של מיקס לכידת אוליגו על רנ"א חיץ הכבילה. גע בעדינות צינורית קצרה ספין מטה את התערובת.
  18. תערובת לפגל על ​​70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  19. לחשל התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות להכין חרוזים במהלך הדגירה זה.
  20. הכן MagBeads אוליגו על ידי שטיפה במים פעם nuclease ללא ואחריו שני שוטף במאגר עקידת 50 μl, ללכוד את החרוזים על מעמד מגנטי בין שוטף. חרוזים Resuspend במאגר עקידת דגירה 50 μl ובו 37 ° C עד השימוש.
  21. מחממים את הפתרון לשטוף כדי 37 מעלות חום לחסום
  22. וורטקס שטף אוליגו MagBeads בעדינות. הוסף 50 μl MagBeads אוליגו ל RNA / ללכוד מערבבים אוליגו. בעדינות מערבבים את הצינור ספין בקצרה.
  23. דגירה לערבב על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  24. מניחים את הצינורית לעמוד המגנטי ולחכות 3 דקות ~.
  25. לשאוב supernatant (מכיל mRNA) ולהעביר אותו צינור איסוף על הקרח.
  26. הוסף 100 μl של פתרון מראש חימם לשטוף את חרוזי בשבי. מערבולת בעדינות את אגלי בקצרה.
  27. לכידת חרוזים להתאושש supernatant. בריכה זו supernatant עם mRNA בצינור האוסף על הקרח (~ 350 נפח סוף μl).
  28. אם בסיבוב השני עומד להתבצע, לחזור סעיף 5.18) לחזור על התהליך. לחילופין, להמשיך מיד mRNA משקעים.
  29. המשקע ו-mRNA resuspend:
    1. כדי להוסיף את ה-mRNA ונקווה 35 נתרן אצטט μl ולהוסיף 7 μl גליקוגן.
    2. הוסף μl 1175 קרח קר EtOH 100% מערבולת ביסודיות.
    3. להאיץ ב -20 מעלות צלזיוס לפחות 1h.
    4. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 10.000 x ז
    5. למזוג בזהירות וזורקים supernatant.
    6. הוסף 750 μl קרח קר EtOH 70% ו בקצרה מערבולת.
    7. צנטריפוגה במשך 5 דקות על XG 10.000 וזורקים supernatant.
    8. האם לשטוף second 70% EtOH.
    9. בקצרה respin הצינור לאחר השלכת הכביסה second 70% EtOH.
    10. בזהירות להסיר כל supernatant עם טפטפת.
    11. האוויר היבש גלולה במשך 5 דקות.
    12. Resuspend גלולה רנ"א 25 μl TE חיץ או מים RNase חינם
    13. רעננותם RNA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    14. וורטקס המדגם נמרץ במקרה הצורך.
  30. אם יש צורך להסיר את החרוזים הנותרים, צינור מקום על דוכן מגנטי עבור ~ 3min ולעבור mRNA מועשר צינור RNase חדש בחינם.
  31. השתמש Bioanalyzer או Experion כדי לבדוק זיהום rRNA ואיכות mRNA בשלב זה.
  32. זוהי נקודת עצירה פוטנציאלי. RNA יכול להיות מאוחסן על אחסון -80 מעלות צלזיוס.

חלק 6: הגברה mRNA

חלק זה משתמש Ambion MessageAmp II-חיידקים הערכה לפי הוראות היצרן. חשב האדון מתערבב באופן מקוון ב www.ambion.com/tools/ma2bact .

  1. Polyadenylation של RNA תבנית:
    1. הנח עד ng 1000 סך של רנ"א (בדרך כלל 100-500 ng) או עד 500 ננוגרם mRNA (בדרך כלל 10 ng ng-200) לתוך צינור RNase ללא סטרילי microfuge. השתמש 6.5 μl של המדגם ואין מים RNase חופשית למאגר הראשון.
    2. דגירה 10 דק 'ב 70 ° C, רצוי thermocycler.
    3. הסר את דגימות רנ"א של 70 ° C החממה בקצרה צנטריפוגה (~ 5 ים) לאסוף דגימת בחלק התחתון של הצינור. מניחים את התערובת על קרח דק 3.
    4. הכן מאסטר מיקס Polyadenylation בצינור nuclease חופשי בכל מקום זמני לפי הסדר המוצג על גיליון החישוב. להרכיב תערובת אמן מספיק עבור כל הדגימות בניסוי, כולל overage ≤ 5% כדי לכסות את השגיאה pipetting. מערבולת בעדינות כדי ליצור תערובת הומוגנית ללא inactivating האנזים, ואז צנטריפוגות במשך 5 ~ s לאסוף את תערובת מאסטר בחלק התחתון של הצינור.
    5. העברת 3.5 μl של מיקס מאסטר Polyadenylation לטעום כל RNA, ומערבבים היטב על ידי vortexing עדין ופעל עם ספין מהיר כדי לאסוף את התגובה.
    6. מניחים את דגימות 37 ° C חממה. תגובות דגירה במשך 15 דקותבשעה 37 ° C, אז בקצרה צנטריפוגות כדי לאסוף את התגובה בתחתית הצינור.
    7. לאחר דגירה 37 מעלות צלזיוס, במקום תגובות על הקרח ולהמשיך מיד שעתוק הפוך.
  2. Reverse Transcription לסנתז סטרנד ראשון cDNA:
    1. הכן מערבבים הפוך מאסטר תמלול בצינור nuclease חופשי בכל מקום זמני לפי הסדר המוצג על גיליון החישוב. להרכיב תערובת אמן מספיק עבור כל הדגימות בניסוי, כולל overage ≤ 5% כדי לכסות את השגיאה pipetting. מערבולת בעדינות כדי ליצור תערובת הומוגנית ללא inactivating האנזים, ואז צנטריפוגות במשך 5 ~ s לאסוף את תערובת מאסטר בחלק התחתון של הצינור.
    2. העברת 10 μl של מיקס מאסטר שעתוק לאחור על כל דגימה, ומערבבים היטב על ידי vortexing עדין, ופעל עם ספין מהיר כדי לאסוף את התגובה.
    3. מניחים את דגימות 42 ° C חממה. דגירה עבור שעה 2 ב 42 ° C, אז צנטריפוגות בקצרה (~ 5 ים) כדי לאסוף את התגובה בתחתית הצינור.
    4. מניחים את הצינורות על הקרח, ומיד להמשיך סינתזה זרם שני cDNA.
  3. סטרנד סינתזה השנייה cDNA:
    1. על קרח, להכין מיקס מאסטר השנייה סטרנד על ידי ערבוב חומרים כימיים הבאים לפי הסדר המוצג בגיליון החישוב. להרכיב תערובת אמן מספיק עבור כל הדגימות בניסוי, כולל overage ≤ 5% כדי לכסות את השגיאה pipetting. מערבולת בעדינות כדי ליצור תערובת הומוגנית ללא inactivating האנזימים, אז צנטריפוגות במשך 5 ~ s לאסוף את תערובת מאסטר בחלק התחתון של הצינור.
    2. העברת 80 μl של מיקס מאסטר סטרנד השני מדגם זה, ומערבבים היטב על ידי vortexing עדין, ופעל עם ספין מהיר כדי לאסוף את התגובה.
    3. מניחים את דגימות Cycler 16 מעלות צלזיוס תרמית. חשוב לקרר את גוש Cycler תרמית עד 16 ° C לפני הוספת התגובה צינורות כי העמדת התגובות לטמפרטורות> 16 ° C תתפשר תשואה ארנה.
    4. דגירה 2 שעות ב 16 ° C דגירה 2 שעה ב Cycler 16 מעלות צלזיוס תרמית. אם טמפרטורת מכסה לא יכול להיות מותאם כדי להתאים את הטמפרטורה 16 ​​° C לחסום, מכסים עם מכסה התגובות המחומם כבוי, או אם המכסה לא יכול להיות כבוי, לא לכסות את הצינורות עם זה.
    5. המקום לתגובות בקצרה על קרח. אל תשאירו את התגובות על קרח לתקופות זמן ארוכות.
  4. 5.4) טיהור cDNA:
    1. כל centrifugations בהליך זה טיהור צריך להיעשות על XG 10,000 (בדרך כלל ~ 10,000 סל"ד) בשעה זמני החדר. בדוק את מאגר עקידת cDNA עבור משקעים לפני השימוש בו. אם המשקע גלוי, redissolve זה על ידי ההתחממות הפתרון 37 ° C עד 10 דקות ו vortexing במרץ. מגניב טמפ החדר לפני השימוש.
    2. לפני תחילת היטהרות cDNA, מחממים את בקבוק 10 מ"ל של מים nuclease חופשי עד 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות.
    3. הוסף 250 μl של הצפת עקידת cDNA לטעום כל ומערבבים היטב בעדינות על ידי vortexing.
    4. צנטריפוגה דקות ~ 1 ב 10,000 גרם, או עד לקבלת תערובת דרך המסנן. מחק את הזרימה דרך להחליף את מחסנית מסנן cDNA בצינור לשטוף.
    5. החל הצפת 500 μl כדי לשטוף כל מחסנית מסנן cDNA. צנטריפוגה דקות ~ 1 ב 10,000 גרם, או עד שכל הצפת שטפי היא דרך המסנן. מחק את הזרימה דרך ספין מחסנית מסנן cDNA במשך דקה נוספת כדי להסיר כמויות זעירות של EtOH.
    6. העברת דיו סינון cDNA לצינור elution cDNA. Elute cDNA עם 20 μl של 50 ° C nuclease ללא מים. חשוב להשתמש nuclease ללא מים זה על 50 מעלות צלזיוס למשך elution cDNA. מים קרות יהיה פחות יעיל משחררי cDNA, מים חמים (> 55 ° C) עלול לגרום תשואה ארנה מופחת.
    7. כדי למרכז המסנן מחסנית מסנן cDNA, להחיל 20 μl של שחומם מראש (50 ° C) מים nuclease חינם. השאירו בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות ואז צנטריפוגות דקות ב 1.5 ~ XG 10000, או עד שכל המים nuclease חופשית היא דרך המסנן. פעמיים תקועים cDNA עכשיו יהיה ב elute (~ 16 μl).
    8. CDNA מטוהרים ניתן לאחסן לילה ב -80 מעלות צלזיוס, בשלב זה, אם תרצה בכך.
  5. בשנת תמלול חוץ גופית לסנתז ארנה
    1. מומלץ להשתמש בתנור הכלאה בגלל טמפרטורה אחידה שלהם, כי זה מאוד חשוב כי התעבות אינו טופס בתוך הצינורות. אנחנו ממליצים על 14 שעות דגירה IVT תגובה על מנת למקסם את התשואה ארנה. לקבלת התשואה הגבוהה ביותר ארנה, התנהלות IVT בנפח תגובה μl 40 הגמר.
    2. באותה טמפ 'חדר, להרכיב מיקס מאסטר IVT ידי הוספת חומרים כימיים כדי הרשום בגיליון החישוב. מערבבים היטב על ידי בעדינות vortexing. צנטריפוגה בקצרה (~ 5 ים) collect מיקס מאסטר IVT בתחתית של התחתית ומניחים על קרח.
    3. העברת IVT מיקס מאסטר לטעום כל ביצוע ההנחיות של גיליון חישוב, ומערבבים היטב על ידי vortexing עדין, צנטריפוגה בקצרה לאסוף את התגובה, והמקום צינורות 37 ° C חממה.
    4. דגירה של 14 שעות ב 37 ° C.
    5. לאחר דגירה, מוסיפים nuclease ללא מים לטעום כל ארנה להביא את נפח הסופי μl 100. מערבבים היטב על ידי vortexing עדין. מניחים את ארנה מדולל על הקרח אם הצעד טיהור ארנה ייעשה מיד. לחלופין, ארנה ניתן לאחסן -20 ° C.
  6. ארנה טיהור
  7. כל centrifugations בסעיף זה צריך להיעשות על XG 10.000 (בדרך כלל ~ 10,000 סל"ד).
  8. לפני תחילת מחממים טיהור ארנה את בקבוק 10 מ"ל של מים nuclease חופשי עד 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות>.
  9. הוסף 350 μl של הצפת ארנה הכבילה למעסיק מדגם ארנה. מערבבים היטב על ידי vortexing עדין, ולהמשיך לשלב הבא באופן מיידי.
  10. הוסף 250 μl של EtOH ACS 100% כיתה לטעום כל ארנה, ומערבבים את התערובת על ידי pipetting למעלה ולמטה 3 פעמים. אל מערבולת לערבב. המשך מיד לשלב הבא ברגע שיש לך מעורבות EtOH לתוך מדגם זה.
  11. הצב סינון ארנה דיו ב Tube אוסף ארנה, ועל פיפטה כל התערובת על מדגם במרכז המסנן מסנן ארנה דיו.
  12. צנטריפוגה דקות ~ 1 ב 10,000 x ז המשך עד לקבלת תערובת עבר דרך הפילטר. מחק את הזרימה דרך ולהחליף את מסנן ארנה דיו התחתית אוסף ארנה.
  13. החל לשטוף μl 650 מאגר זה סינון ארנה דיו. צנטריפוגה דקות 1 ~ ב XG 10000, או עד שכל פתרון לרחוץ היא דרך המסנן. מחק את הזרימה, דרך הספין סינון ארנה דיו נוסף ~ 1 דקות להסיר כמויות זעירות של EtOH.
  14. העברת מסנן Cartridge (ים) Tube ארנה טרי האוסף. כדי למרכז לסנן, להוסיף מים 75 μl nuclease חופשי כי הוא שחומם מראש ל 50-60 ° C. החלף את מיכל המים nuclease חינם של 50-60 מעלות צלזיוס חממה.
  15. השאירו בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות ואז צנטריפוגות דקות ב 1.5 ~ XG 10000, או עד הפתרון הוא דרך המסנן.
  16. חזור על elution עם μl 75 השני של מים nuclease חינם. ארנה עכשיו יהיה התחתית אוסף ארנה ב μl 150 ~ מים nuclease חינם. בטל את מסנן ארנה דיו.
  17. חנות ארנה ב -80 ° C ו למזער חזר להקפיא הפשרה.

חלק 7: סינתזה cDNA

חלק זה משתמש יוניברסל Promega RiboClone ערכת cDNA מערכת סינתזה עם שינויים קלים הוראות היצרן. מיקרוגרם רגיל 2 קלט; עבור סידור 454, מומלץ להתחיל עם 10 מיקרוגרם. אם ריכוז נמוך מדי, ארנה ניתן מרוכז עם משקעים או EtOH ריכוז או ואקום. אם 10 מיקרוגרם משמש קלט RNA אז בקנה מידה כל ריאגנטים עד בפקטור של אנזימים 5The לבוא ביחידות שונות כל אצווה, ובכך כרכים צריך להיות מחושב בכל פעם.

  1. סטרנד ראשון סינתזה:
    1. קחו צינור 0.5 מ"ל PCR ולהוסיף:
      mRNA מדגם 2 מיקרוגרם (או 10 מיקרוגרם אם נעשה שימוש עבור סידור 454)
      Hex פריימר אקראית (0.5 מ"ג / מ"ל) 2 μl
      Nuclease מים חופשיים נפח 0 (או הלא הוא המדגם היה לדלל)
      סך נפח 15 μl
    2. מחממים את התגובה עד 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. צ'יל צינור על קרח דק 5 ו ספין בקצרה לאסוף את הפתרון בתחתית של התחתית.
    3. מוסיפים את הרכיבים הבאים לפי הסדר המוצג:
      מדגם 15 μl
      סטרנד הצפת ראשון 5X 5 μl
      RNasin Ribonuclease אינהיביטור 40 u Μl 1 ... 40 u / μl
      סך נפח 21 μl
    4. מערבבים reaction ו בקצרה ספין. תערובת מחממים על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    5. מוסיפים את הרכיבים הבאים:
      לדוגמא משלב 1 21.0 μl
      Pyrophosphate נתרן, 40 מ"מ 2.5 μl
      AMV הפוך Trancriptase 30 u Μl 1.5 ... 22 u / μl
      Nuclease מים חינם 0.0 μl
      סך נפח 25.0 μl
    6. דגירה תגובה עבור 1 שעה בשעה 37 ° C בתנור הכלאה.
    7. לאחר תגובת הדגירה מקום על הקרח.
  2. שנית, סטרנד סינתזה:
    1. מוסיפים את הרכיבים הבאים:
      ראשון סטרנד תגובה 25.0 μl
      מאגר השנייה 2.5x סטרנד 40.0 μl
      ארגון ה-BSA, 1 מ"ג / מ"ל 5.0 μl
      DNA פולימראז אני 23 u 3.0 μl
      RNase H 0.8 u Μl 0.5 ... 1.5 u / μl
      Nuclease מים חינם Μl 26.5
      סך נפח 100.0 μl
    2. מערבבים בעדינות על ידי מצליף את הצינורית. דגירה התגובות על 14 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ב thermocycler. חשוב לקרר את thermocycler עד 14 ° C לפני הוספת התגובה צינורות. אל תתנו התגובה לקבל מעל 14 מעלות צלזיוס לפני או במהלך התגובה.
    3. כדי להפסיק את התגובה, להוסיף 2 יחידות של ה-DNA פולימראז T4 ל-mRNA מיקרוגרם קלט התגובה. דגירה של 10 דקות בשעה 14 ° C.
    4. עצור את התגובה על ידי הוספת 10 μl של DEPC 500 mM EDTA ובמקום טופלו על הקרח.
    5. נקו את cDNA או באמצעות משקעים EtOH או באשף Promega-DNA ניקוי המערכת על פי הוראות היצרן. חנות דגימות ב -80 ° C. פעמיים תקועים cDNA ניתן pyrosequenced ישירות בשלב זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

החקירה של ביטוי גנים על ידי קהילות מיקרוביאלי טבעי הפך נפוץ בשנים האחרונות כאמצעי לחקור את התפקידים האקולוגיים פונקציות של מיקרואורגניזמים. בשילוב עם זיהוי, כימות, ואפיון של מיקרואורגניזמים ימיים, ניתוח של ביטוי גנים ניתן להשתמש כדי לקשר תולדות הגזע לתפקד קהילות מיקרוביאלי טבעי. טכניקות רבות עבור מיקוד ביטוי גנים פונקציונליים להסתמך על בדיקות ספציפיות או קבוצות פריימר מיועד הגנים של רצף ידוע. לעומת זאת, transcriptomics סביבתיים יכולים לשמש לבדיקת ביטוי גנים ללא מגבלות שהוטלו על ידי רצף נתונים קיימים עם העדפה של הגנים האלה לידי ביטוי באופן פעיל. ניתוח של הבריכה mRNA בסביבה ולכן יכול לספק אחת הדרכים היעילות ביותר של קשרים בין פעילויות גילוי המפתח ואת אורגניזמים לתווך אותם.

היישום הראשוני של transcriptomics סביבתיים הניתנים באחת התצוגות הראשון של ההרכב והדינמיקה של הבריכה mRNA חיידקים 3 מערכת אקולוגית טבעית. ניתוח של ביטוי גנים בספריות תמליל משני חוף מלח ביצה (Sapelo איילנד, GA) ו אלקליין, hypersaline אגם (אגם מונו CA) חשף רצפי גנים עניין biogeochemical, כולל וריאנטים של גנים פעילים סביבתיים שונים כגון chitinases וגופרית חמצון גנים ספציפיים היו לכל אחת המערכות האקולוגיות האלה. הוא גם סיפק ראיות, תהליכים רומן בלתי צפוי כגון פירוק מיקרוביאלי של פוליאמינים צמחים אצות ו-derived כלי דם כמו פחמן אפשרי מקורות חנקן.

כמו בטכניקות מולקולריות להתפתח כדי לצמצם את המגבלות הקשורות בעבודה עם RNA דגימות סביבתיות רצף טכנולוגיות לשפר, transcriptomics הסביבה הפכה יותר טכניקה בשימוש נרחב. זה כבר נעשה שימוש כדי לבחון את הפונקציות של מיקרואורגניזמים פני הים 6 ולהשוות יום ביטוי פונקציונלית לילה גן בסביבת אותו 7. Transcriptomics הסביבה יכול לשמש גם להשגת הבנה טובה יותר של חיידקים התגובות לגורמים סביבתיים ספציפיים biogeochemistry. גנים או פונקציות גילו באמצעות טכניקה זו יכולה לשמש מטרות עבור מחקרים נוספים כמותית של ביטוי גנים כמו microarrays ו PCR כמותי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

המימון ניתן על ידי גורדון ובטי מור קרן מענקי הקרן הלאומית למדע מענק MCB-0702125.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PowerSoil Bead Tubes kit MoBio 12866-25-PBT
RNeasy Mini Kit kit Qiagen 74104
TURBO DNA-free kit Ambion AM1907
mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit kit Epicentre Biotechnologies MOP51010/MOP51024
MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit kit Ambion AM1905
MICROBEnrich kit kit Ambion AM1901
MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit kit Ambion AM1790
Universal RiboClone cDNA Synthesis System kit Promega Corp. C4360
Wizard DNA Clean-Up System kit Promega Corp. A7280

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
  2. Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).
  3. Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).
  4. Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
  5. Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
  6. Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
  7. Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).

Tags

מיקרוביולוגיה גיליון 24 transcriptomics bacterioplankton ה-mRNA קהילות מיקרוביאלי ביטוי גנים
ניתוח ביטוי גנים מקהילות מיקרוביאלית ימית באמצעות Transcriptomics הסביבה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poretsky, R. S., Gifford, S.,… More

Poretsky, R. S., Gifford, S., Rinta-Kanto, J., Vila-Costa, M., Moran, M. A. Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics. J. Vis. Exp. (24), e1086, doi:10.3791/1086 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter