Summary
우리는 환경 mRNA로부터 cDNA 생성하는 방법을 제시한다. 일반적으로, 총 RNA는 먼저 환경에서 수집, rRNA는 선택, 제거 mRNA가 선택적으로 증폭되고 농축 mRNA 수영장에서 합성된 cDNA가 합성됩니다. 복구된 시퀀스는 표현 유전자를 식별하는 표준 생물 정보학 기술을 사용하여 주석하실 수 있습니다.
Abstract
metagenomics 유사, 환경 transcriptomics (metatranscriptomics) 검색 및 커뮤니티 표현이 될 일을 유전자의 사전 지식없이도 미생물의 조립에서 시퀀스 환경 mRNAs합니다. 그러므로 그것은 사회의 유전자 발현에 가장 불편 관점을 제공합니다
Protocol
RNA 작업
RNases는 유비 쿼터스하고 mRNAs 미행해야하며 샘플을 처리하거나 가능한 한 빨리 다음과 같은 모음으로 보존되어야 ribonuclease없는 환경에서 작업을 위해 신속하게 표준 예방 조치를 저하 때문입니다.
1 부 : 환경 RNA 컬렉션 (0.2-3.0 μm의 크기 분율에 바이오 매스를 수집하기위한)
소모품이 필요 :
Masterflex 튜빙
연동 펌프
3 μm의 대량 내기 캡슐 필터
0.22 μm의 Supor 또는 폴리 카보 네이트 142mm 필터
142mm 필터 타워 (Geotech 환경 장비)
10-20 L 상자 속에 든 대형 유리병 (졸업)
월 팩
액체 질소
RLT 버퍼 (Qiagen)
베타 - 메르 캅 토 에탄올
설정 :
필터를 취급하거나 필터 라인의 내부 구성 요소를 만지 때마다 청소 장갑을 착용한다. 집게가 선호 에탄올로 가득 깨끗하고, 50 ML 원뿔 튜브에 보관해야합니다. 성적 증명서 수영장의 주요 변경을 방지하기 위해 필터링 유지하고 샘플 처리 시간이 가능한 한 짧은처럼.
샘플링에 원하는 깊이의 물속에 튜브의 한쪽 끝을 놓으십시오. 반대 끝에, 3 μm의 필터를 높은 볼륨을 첨부합니다. 0.22 μm의 필터 타워 필터 3 μm의를 연결합니다. 졸업 상자 속에 든 대형 유리병에 0.22 μm의의 유출을 직접.
절차 :
- 헹굼 수있는 시스템을 통해 물을 몇 리터 (NO 0.22 μm의 필터)를 실행합니다. 펌프 라인에서 남은 물을 정화하기 위해 실행되는 동안 작업이 완료되면 물에서 튜브를 제거합니다.
- 포셉를 사용하여 필터 타워와 가까이에 필터 0.22 μm의 배치.
- 다시 물에 라인의 끝을 놓고 펌프를 켜십시오. 필터 양쪽의 공기를 정화. 상자 속에 든 대형 유리병에 졸업과 함께 필터 물의 볼륨을 모니터링합니다.
- 원하는 볼륨이 필터링되면, 물에서 라인을 제거하고 시스템에서 남아있는 물을 정화.
- 마자 필터가 건조 한, 신속하게 상단 필터 플레이트를 제거하고 필터를 접어. 변덕 팩 또는 베타 - 메르 캅 토 에탄올과 RLT 버퍼 2 ML을 포함한 15 ML 수집 관에 필터를 놓습니다. 액체 질소로 동결을 스냅.
2 부 : 0.22 μm의 필터에서 총 RNA 추출
이 부분은 제조 업체의 지침을 수정 QIAGEN RNeasy 미니 키트를 사용하여
- 50 ML 원뿔 관에 RLT 버퍼 8 ML (베타 메르 캅 토 에탄올 추가)를 추가하여 비드 뛰는 튜브를 준비합니다. MoBio Powersoil 추출 키트에서 RNA 비즈 1-2 ML 추가
- 신속하게 냉동실에서 냉동 필터를 제거하고, 소용돌이 팩에 보관, 망치로 산산조각. 또는 멸균 면도날을 사용하여 컬렉션 튜브의 작은 조각 (15ml)에 필터를 잘라 준비 튜브 (50ml)에 모두 추가합니다.
- 준비 튜브 (50ml)에 부서진 필터를 추가하고 parafilm 또는 연구소 테이프와 튜브 뚜껑을 밀봉.
- 50 ML 튜브에 대한 첨부 파일 vortexer를 사용하여 최고 속도 10 분 와동.
- 상온에서 1 분 5,000 rpm으로 50 ML 튜브를 원심 분리기.
- 많은 lysate의 가능한 제거하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 5000 X G.에서 5 분 15 ML 튜브를 원심 분리기
- 새로운 50 ML 튜브로 전송 뜨는 (~ 7 ML).
- lysate에 100 % EtOH 1 볼륨 (~ 7 ML) 추가합니다.
- 50 ML 튜브에 맞는 30 ML의 주사기를 사용하여, 18-21 게이지 바늘을 통해 lysate를 꺼내는 ~ 5 배 밖으로 다시 그것을 전달한다. 완료되면, 주사기의 lysate를 두십시오.
- QIAGEN RNeasy 미니 키트와 함께 추출을 계속하십시오. lysate 볼륨 (~ 14ml)이 원래의 키트 프로토콜 (0.7 ML)보다 훨씬 높습니다 때문에, 여기 진공 매니폴드를 사용하는 도움이됩니다. 또는 lysate는 그 결과 해당 컬럼에 700 μl를 추가 centrifuging하고 lysate의 모든 컬럼에 적용되었습니다 때까지 반복하여 통해 발행한 수 있습니다.
- 진공 매니폴드에 스핀 컬럼을 놓고 시료 700 μl를 적용합니다. lysate를 그릴 매니폴드에 진공 압력을 적용합니다. 그것의 모든 컬럼에 적용되었습니다 때까지 주사기의 lysate를 계속 추가합니다.
- 그 결과 해당 컬럼에 700 μl 버퍼 RW1을 추가하고 진공 압력 아래로 그립니다.
- 열 500 μl 버퍼 RPE를 추가하고 진공 압력 아래로 그립니다.
- 열 500 μl 버퍼 RPE의 두 번째 나누어지는을 추가하고 진공 압력 아래로 그립니다.
- 씻어 완전히 통해 그려진되면 컬렉션 튜브에 열을과 장소를 제거합니다.
- 8000 X G. 1 분 튜브를 원심 분리기 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
- EtOH 없애 XG 8000에서 추가로 2 분 원심 분리기.
- 새로운 두 ML 열로 열을 전송성귀 튜브. 직접 멤브레인에 RNase 무료 물을 피펫 35 μl. 튜브를 닫고 1 분 이러고.
- 8000 X G. 2 분 원심 분리기
- spectrophotometrically 총 RNA를 계량.
부 3. DNAse 치료
이 부분은 제조 업체의 지침에 따라 앰비온 터보 DNA없는 키트를 사용하여
- RNA 샘플 3.4 μl 10X DNase I 버퍼와 1μl rDNase I를 추가합니다.
- 30 분에 대한 37 º C에서 알을 품다.
- 소용돌이는 샘플로 불활 성화 시약 3.4 μl를 DNase의 불활 성화 시약과를 추가합니다.
- 가끔 혼합과 상온에서 2 분 알을 품다.
- 상온에서 1.5 분 10.000 XG에서 스핀 후, 새로운 튜브에 뜨는을 전송하기만하면됩니다. 신선한 튜브에 불활 성화 시약을 도입하지 마십시오.
부 4. 첫 rRNA 제거
이 부분은 제조 업체의 지침에 따라 Epicentre mRNA 전용 키트를 사용하여
- 부드럽게 섞어 간단히 사용하기 전에 mRNA 전용 10X 반응 완충액을 원심 분리기.
- 멸균 (RNase - 무료) 0.5 ML 관에서 얼음에 다음과 같은 반응 구성 요소를 결합 :
mRNA 전용 10X 반응 완충액 2.0 μl RNase 억제제 0.5 μl 총 RNA 샘플 (200 NG - 10 μg) μl 16.5 터미네이터의 Exonuclease (1 단위) 1.0 μl 총 부피 20.0 μl - 30 반응을 품어 ° 60 thermocycler에 분 (온수 뚜껑이있는) 또는 물 목욕을위한 C.
- 페놀 / EtOH 강수로 반응을 종료 :
- 200 μl의 총 부피 (= 180 μl)로 RNase - 무료 H2O 추가합니다.
- 추출 : 페놀 : 클로로포름 (1:1), 1 볼륨 (= 200 μl). 와동이 적극적으로 그리고 최고 속도로 2-5 분 스핀.
- 수성 단계 (~ 200 μl)를 제거합니다.
- 3 M의 아세트산 나트륨 (20 μl) 100 % EtOH 차가운 얼음의 부피 + 2.5 (500 μl)의 0.1 볼륨 추가
- 15-30 분 -80 º C에서 알을 품다.
- 4 º C, 최고 속도, 30 분 펠렛은, 샘플의 이후 열망 (펠렛보고 어려울 수 있습니다)에 대한 튜브의 위치를 적어 둡니다.
- 흡인기 또는 피펫과 함께 뜨는 폐기하십시오.
- 500 μl 70 % 얼음 차가운 EtOH로 씻으십시오. vortexing하여 Resuspend.
- 최고 속도 10 분 원심 분리기. 뜨는 폐기하십시오.
- 튜브 다시 정상 속도로 10 분에 남아있는 액체를 원심 분리기.
- 신중하게 액체를 대기음하고 후드 아래에 ~ 10 분 열어두고으로 완전히 펠릿 건조.
- 15-20 μl RNase 무료 H2O에서 Resuspend (MICROBExpress의 최대 입력 음량 것은 15 μl이다), 그것이 실온에서 5 분 서 보자.
- 이 단계에서 mRNA의 rRNA 오염 및 품질 확인을 위해 Bioanalyzer 또는 Experion을 사용합니다.
- 이것은 잠재적인 중단 지점입니다. RNA는 -80 º C 스토리지에 저장할 수 있습니다.
제 5 부. 둘째 rRNA 제거
이 부분은 제조 업체의 지침에 따라 앰비온 MICROBEnrich 및 MICROBExpress 키트를 사용합니다. 두 키트는 진핵세포의 효율성 (MICROBEnrich)과 prokaryotic (MICROBExpress) rRNA 제거를 높이기 위해 여러 번 사용할 수 있습니다. 총 RNA의 입력은 2-10 μg 사이 여야합니다. RNA의 볼륨 미만 15 μl해야합니다. 따라서, 이상적인 입력> 150 NG / μl입니다. -
MICROBEnrich
- 1.5ml 튜브에 피펫 300 μl 바인딩 버퍼
- 30μl 부드럽게 소용돌이의 최대 볼륨에서 5-100 μg 총 RNA를 추가
- 바인딩 버퍼에 5 μg의 RNA에 대한 캡처 Oligo 믹스 2 μl를 추가합니다. 부드럽게 튜브를 누르고 간단히 혼합물을 스핀.
- 10 분 70시 변성 혼합물은 ° C
- 37 ° C 1 시간을위한 혼합물을 어닐링. 이 부화하는 동안 구슬을 준비합니다.
- nuclease없는 물에 한 번 씻고 한번 바인딩 버퍼에, 세척 사이에 자기 증언대에 비즈를 캡처하여 Oligo MagBeads (대개 25 μl) 준비합니다. 얼음 구슬을 저장합니다. 사용하기 전에 실온 5 분 그들을 따뜻하게.
- ° C 열 블록에서 37로 씻으 솔루션을 열.
- RNA 추가 / 세탁 Oligo의 MagBeads에 Oligo 믹스를 캡처합니다. 아주 부드럽게 튜브를 믹스하고 간단히를 스핀.
- 37 믹스 ° C 15 분 품어.
- 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 ~ 3 분 기다립니다.
- 기음 뜨는 (mRNA를 포함)와 얼음이 컬렉션 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 캡쳐 구슬을 미리 따뜻하게 씻으 솔루션 100 μl를 추가합니다. 간단히 부드럽게 와동 비즈. 구슬을 캡처하여 뜨는 복구할 수 있습니다. 얼음 (~ 450 μl 최종 볼륨)에 수집 튜브의 mRNA와 수영장이 뜨는합니다.
- 얼음 모음 튜브를 놓습니다. 두 번째 라운드가 수행 될 경우) 다시 5.3로 섹션을 이동하여 절차를 반복합니다. 또는 MICROBExpress 키트 (5.18, 아래 참조)로 즉시 전환합니다.
- 사용 OlioBeads은 두 번째 시간을 사용할 수 있습니다. 1 시간에 대한 재생 솔루션 1 2 권 (대개 50 μl)으로 그들을 잠복기로 Oligobeads을 재생. 자기 스탠드에 비즈를 캡처합니다. 재생 솔루션 2 (대개 50 μl) 2 볼륨을 두 번 씻고 Resuspension 솔루션의 원래 볼륨 (보통 25 μl)에서 그들을 resuspend.
MICROBExpress - 1.5ml 튜브에 피펫 200 μl 바인딩 버퍼.
- 15μl 부드럽게 소용돌이의 최대 볼륨에서 2-10 μg 총 RNA를 추가합니다.
- 바인딩 버퍼에 RNA에 캡처 Oligo 믹스 4 μl를 추가합니다. 부드럽게 튜브를 누르고 간단히 혼합물을 스핀.
- 70 변성 혼합 ° C 10 분.
- 15 분이 부화하는 동안 구슬을 준비 ° C가 37 혼합물을 어닐링.
- nuclease없는 물에 한 번 세척하여 Oligo의 MagBeads 준비는 세척 사이에 자기 증언대에 비즈를 캡처, 50 μl 바인딩 버퍼에있는 두 씻는다 다음. 37 50 μl 바인딩 버퍼와 부화에 Resuspend 비즈 ° C까지 사용.
- 37 와시 솔루션을 열 ° C 열 블록
- 와동이 부드럽게 Oligo MagBeads을 빨기도 했죠. RNA / Oligo 믹스를 캡처 50 μl Oligo의 MagBeads를 추가합니다. 아주 부드럽게 튜브를 믹스하고 간단히를 스핀.
- ° C 15 분 37 믹스를 품어.
- 자기 스탠드에 튜브를 삽입하고 ~ 3 분 기다립니다.
- 기음 뜨는 (mRNA를 포함)와 얼음이 컬렉션 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 캡쳐 구슬을 미리 따뜻하게 씻으 솔루션 100 μl를 추가합니다. 간단히 부드럽게 와동 비즈.
- 구슬을 캡처하여 뜨는 복구할 수 있습니다. 얼음 (~ 350 μl 최종 볼륨)에 수집 튜브의 mRNA와 수영장이 뜨는합니다.
- 두 번째 라운드가 수행 될 경우, 섹션 5.18)로 돌아가서 절차를 반복합니다. 또는 석출을 mRNA 즉시 진행합니다.
- 침전물과 resuspend mRNA :
- 하려면 풀링 mRNA는 35 μl 아세트산 나트륨을 추가 7 μl 글리코겐을 추가합니다.
- 1175 μl 얼음 차가운 100 % EtOH를 철저 와동을 추가합니다.
- 적어도 1 시간을 위해 -20 ° C에서 침전물.
- 10.000 X G. 30 분 원심 분리기
- 조심스럽게 가만히 따르다 및 뜨는 폐기하십시오.
- 750 μl 얼음 차가운 70 % EtOH 및 소용돌이 간단히 추가합니다.
- 10.000 XG에서 5 분 원심 분리기 및 뜨는 폐기.
- 두 번째 70% EtOH 세척 해.
- 간단히 폐기 후 튜브를 두 번째 70% EtOH 세척을 respin.
- 조심스럽게 피펫과의 뜨는을 제거합니다.
- 에어 5 분 펠릿 건조.
- 25 μl TE 버퍼 또는 RNase 무료 물속에 RNA 펠릿을 Resuspend
- 실온에서 15 분에 대한 RNA를 Rehydrate.
- 적극적으로 필요한 경우 소용돌이 샘플을.
- 그것이 필요한 경우 ~ 3min에 대한 자성 서에 남아있는 구슬, 장소 튜브를 제거하고 새로운 RNase 무료 관에 농축 mRNA를 이동합니다.
- 이 단계에서 mRNA의 rRNA 오염 및 품질 확인을 위해 Bioanalyzer 또는 Experion을 사용합니다.
- 이것은 잠재적인 중단 지점입니다. RNA는 -80 º C 스토리지에 저장할 수 있습니다.
6 부 : mRNA의 증폭
이 부분은 제조 업체의 지침에 따라 앰비온 MessageAmp II - 박테리아 키트를 사용합니다. 마스터에서 온라인으로 혼합 계산 www.ambion.com/tools/ma2bact .
- 템플릿 RNA의 Polyadenylation :
- 총 RNA 1000 NG (일반적으로 100-500 NG) 또는 멸균 RNase 무료 microfuge 튜브로 최대 500 NG의 mRNA (일반적으로 10 NG - 200 NG)까지 넣습니다. 첫 번째 버퍼에 6.5 시료의 μl RNase없이 무료로 물을 사용합니다.
- 선호 thermocycler에서 70 ° C에서 10 분 알을 품다.
- 튜브의 맨 아래에 샘플을 수집하기 위해 70 ° C 배양기와 원심 분리기의 잠시 (~ 5 S)에서 RNA 샘플을 제거합니다. 3 분위한 얼음에 섞어 놓으십시오.
- 계산 시트에 표시된 순서에 따라 온도는 실온에서 nuclease없는 튜브 Polyadenylation 마스터 믹스를 준비합니다. pipetting 오류를 충당하기 위해 ≤ 5 % 없더군요 포함한 실험의 모든 샘플을 충분히 마스터 믹스를 조립. 효소의 운영을 중지시키지 않고 동질적인 혼합을 위해 부드럽게 소용돌이 후 튜브의 하단에있는 마스터 믹스를 수집하는 ~ 5 s에 대한 원심 분리기.
- 각 RNA 샘플을 Polyadenylation 마스터 믹스 3.5 μl를 전송 부드러운 vortexing에 의해 철저하게 혼합하고 반응을 수집하는 빠른 스핀과 함께하십시오.
- 37 ° C 배양기에서 샘플을 놓으십시오. 15 분 품어 반응37 ° C 후 튜브 하단의 반응을 수집 간단히 원심 분리기.
- 37 ° C 보육 후, 얼음에 반응을 배치하고 반대 전사 즉시 진행합니다.
- 먼저 스트랜드는 cDNA 합성에 전사를 역방향 :
- 계산 시트에 표시된 순서에 따라 온도는 실온에서 nuclease없는 튜브에서 역방향 전사 마스터 믹스를 준비합니다. pipetting 오류를 충당하기 위해 ≤ 5 % 없더군요 포함한 실험의 모든 샘플을 충분히 마스터 믹스를 조립. 효소의 운영을 중지시키지 않고 동질적인 혼합을 위해 부드럽게 소용돌이 후 튜브의 하단에있는 마스터 믹스를 수집하는 ~ 5 s에 대한 원심 분리기.
- 부드러운 vortexing으로 철저하게 혼합하고 반응을 수집하는 빠른 스핀과 함께 따라, 각 샘플에 역방향 전사 마스터 믹스 10 μl을 전송합니다.
- 42 ° C 배양기에서 샘플을 놓으십시오. 42 2 시간에 대한 품어 ° C, 그때 튜브 하단의 반응을 수집 (~ 5 S) 간략 원심 분리기.
- 얼음에 튜브를 삽입하고 바로 두 번째 가닥 cDNA 합성을 수행합니다.
- 둘째 스트랜드 cDNA 합성 :
- 얼음에서 계산 시트에 표시된 순서대로 다음과 같은 시약을 혼합하여 두 번째 스트랜드 마스터 믹스를 준비합니다. pipetting 오류를 충당하기 위해 ≤ 5 % 없더군요 포함한 실험의 모든 샘플을 충분히 마스터 믹스를 조립. 효소의 운영을 중지시키지 않고 동질적인 혼합을 위해 부드럽게 소용돌이 후 튜브의 하단에있는 마스터 믹스를 수집하는 ~ 5 s에 대한 원심 분리기.
- 부드러운 vortexing으로 철저하게 혼합하고 반응을 수집하는 빠른 스핀과 함께 따라, 각 샘플에 두 번째 스트랜드 마스터 믹스 80 μl을 전송합니다.
- 16 ° C 온도 자전거 타는 사람에있는 샘플을 놓으십시오. 그것은 16 ° C 온도에 반응> 16 ° C가 아르나 수율을 위해서야 쓰는 때문에 반응 튜브를 추가하기 전에 열 자전거 타는 사람의 블록을 냉각하는 것이 중요합니다.
- 16 2 시간을 품어 ° 16 ° C 온도 자전거 타는 사람에 C 품어 2 시간. 뚜껑 온도가 16 ° C 블록의 온도와 일치하도록 조정할 수 없다면, 온수 뚜껑이 해제된 상태로 반응을 커버하거나, 뚜껑이 설정되어 수없는 경우 외부 어떻게 그걸로 튜브를 커버하지 않습니다.
- 얼음 간단히에 대한 반응을 놓으십시오. 오랜 기간 동안 얼음에 반응을 두지 마십시오.
- 5.4) cDNA 정제 :
- 이 정화 과정의 모든 centrifugations는 방 온도 10,000 XG (일반적으로 ~ 10,000 RPM)에서 수행되어야합니다. 그것을 사용하기 전에 석출에 대한 cDNA 바인딩 버퍼를 확인합니다. 침전물이 표시되면, 37 ° C까지 10 분 수있는 솔루션을 온난 화와 적극적으로 vortexing하여 redissolve. 사용하기 전에 적당한 온도로 쿨.
- cDNA 정제를 시작하기 전에 앞서 열을 가하다 50 ° C 적어도 10 분 Nuclease없는 물 10 ML 병.
- 각 샘플에 cDNA 바인딩 버퍼 250 μl를 추가하고 부드럽게 vortexing하여 철저히 섞는다.
- 1만그램에서 ~ 1 분 원심 분리기, 또는 혼합물은 필터를 통해 때까지. 흐름 -을 통해를 버리고 씻어 튜브의 cDNA 필터 카트리지를 교체하십시오.
- 각 cDNA 필터 카트리지 500 μl 씻으 버퍼를 적용합니다. 1만그램에서 ~ 1 분 원심 분리기, 또는 모두 씻어 버퍼는 필터를 통해 때까지. 흐름 -을 통해를 버리고 EtOH의 상당량을 제거하는 추가적인 분에 대한 cDNA 필터 카트리지를 스핀.
- cDNA 용출 튜브로 cDNA 필터 카트리지를 전송합니다. 50 ° C Nuclease없는 물 20 μl와 cDNA Elute. cDNA 용리 50에 있습니다 Nuclease없는 물 ° C를 사용하는 것이 중요합니다. 콜더 물을 덜 cDNA를 eluting에서 효율적으로, 그리고 뜨거운 물 (> 55 ° C) 감소 아르나 수율이 발생할 수 있습니다. 것입니다
- cDNA 필터 카트리지 필터의 중심하려면, preheated (50 ° C) Nuclease없는 물 20 μl를 적용합니다. 10,000 XG에 ~ 1.5 분 원심 분리기 다음 2 분 상온에서두고, 또는 때까지 모든 Nuclease없는 물이 필터를 통해이다. 이중 좌초 cDNA 지금 elute (~ 16 μl)에됩니다.
- 원하는 경우 정화 cDNA는 -80 ° C에서이 시점에서 하룻밤 저장할 수 있습니다.
- 시험 관내 전사에 아르나을 합성하기 위해
- 이것은 때문에 그들의 제복 온도 하이브 리다이 제이션 오븐을 사용하는 것이 좋습니다, 그리고 그것은 응축은 튜브 내부 양식을하지 않는 매우 중요합니다 때문입니다. 우리는 강력하게 아르나 수율을 최대화하기 위해 14 시간 IVT 반응 보육을 권장합니다. 최고 아르나 수율 경우, 40 μl 반응 최종 볼륨에서 IVT를 실시하고 있습니다.
- 방 온도에서 계산 시트에 나열된 순서대로 시약을 추가하여 IVT 마스터 믹스를 조립. 부드럽게 vortexing하여 잘 섞는다. 콜하는 원심 분리기의 잠시 (~ 5 S)얼음 튜브와 장소의 하단에있는 IVT 마스터 믹스 lect.
- 계산 시트의 지침에 따라 각 샘플을 전송 IVT 마스터 믹스는 부드러운 vortexing에 의해 철저하게 혼합, 반응을 수집 간단히 원심 분리기, 그리고 37 ° C 배양기에서 튜브를 놓으십시오.
- 37 14 시간을위한 품어 ° C.
- 부화 후, 100 μl로 최종 볼륨을 얻을 수 있도록 각 아르나 샘플을 Nuclease없는 물을 추가합니다. 부드러운 vortexing으로 철저히 섞는다. 아르나 정화 단계가 즉시 완료됩니다 경우에는 얼음에 희석 아르나를 놓습니다. 또는, 아르나는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다
- 아르나의 정제
- 이 섹션의 모든 centrifugations은 10.000 XG (일반적으로 ~ 10,000 RPM)에서 수행되어야합니다.
- 55 아르나 정화 앞서 열을 가하다 Nuclease없는 물 10 ML 병을 시작하기 전에 ° C> 10 분.
- 각 아르나 샘플에 아르나 바인딩 버퍼 350 μl를 추가합니다. 부드러운 vortexing으로 철저하게 혼합하고, 즉시 다음 단계로 진행합니다.
- 3 번 다운 혼합물을 pipetting하고 250에 의해 각 아르나 샘플로 ACS 등급 100 % EtOH의 μl와 혼합을 추가합니다. 섞어 와동하지 마십시오. 바로 각 샘플에 EtOH를 혼합 것처럼 다음 단계로 바로 진행합니다.
- 아르나 수집 튜브에 아르나 필터 카트리지를 삽입하고, 아르나 필터 카트리지 필터의 중앙에 각 시료 혼합물을 피펫.
- 10,000 X G.에서 ~ 1 분 원심 분리기 혼합물이 필터를 통과 때까지 계속합니다. 흐름 -을 통해를 버리고 아르나 컬렉션 튜브에 아르나 필터 카트리지를 교체하십시오.
- 각 아르나 필터 카트리지에 650 μl 씻으 버퍼를 적용합니다. 10,000 XG에서 ~ 1 분 원심 분리기, 또는 모든 세척 솔루션은 필터를 통해 때까지. 흐름 -을 통해을 취소하고 추가 ~ 1 분 EtOH의 상당량을 제거하는 아르나 필터 카트리지를 스핀.
- 신선한 아르나 컬렉션 튜브로 전송 필터 카트리지 (S). 필터의 중심하려면, 50-60에 preheated는 75 μl Nuclease 무료 물 ° C.를 추가 50-60 ° C 배양기에서 Nuclease없는 물의 용기를 교체합니다.
- 10,000 XG에 ~ 1.5 분 원심 분리기 다음 2 분 상온에서두고, 또는 때까지 해결 방법은 필터를 통해이다.
- Nuclease없는 물의 두 번째 75 μl로 용출을 반복합니다. 아르나 지금 Nuclease없는 물 ~ 150 μl의 아르나 컬렉션 튜브있을 것입니다. 아르나 필터 카트리지를 폐기하십시오.
- -80에서 보관 아르나 ° C 및 냉동 해동 반복 최소화합니다.
7 부 : cDNA 합성
이 부분은 제조 업체의 지시에 약간의 수정과 함께 Promega 범용 RiboClone cDNA 합성 시스템 키트를 사용합니다. 표준 입력이 μg는, 454 시퀀싱을 위해, 그것은 10 μg으로 시작하는 것이 좋습니다. 농도가 너무 낮으면, 아르나는 EtOH의 석출 또는 진공 중 농도와 농축 수 있습니다. 10 μg가 RNA의 입력으로 사용하는 경우 다음과 같이 각 배치 다른 단위로 와서 5The 효소의 요소에 의해 모든 시약을 규모, 따라서 볼륨은 각 시간을 계산해야합니다.
- 첫 스트랜드 합성 :
- 0.5 ML PCR 튜브를 타고 추가
mRNA 샘플 2 μg (또는 10 μg 454 시퀀싱에 사용하는 경우) 랜덤 헥스 프리머 (0.5 MG / ML) 2 μl 볼륨 Nuclease 무료로 물 0 (또는 이외의 샘플은 희석되었습니다입니다) 총 볼륨 15 μl - ° C 10 분 70에 반응을 가열. 5 분 얼음에 튜브를 차리고 튜브 하단에있는 솔루션을 수집 간단히 스핀.
- 표시된 순서대로 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다
견본 15 μl 먼저 스트랜드 5 배 버퍼 5 μl RNasin Ribonuclease 억제제 40 U μl 1 ... 40 U / μl 총 볼륨 21 μl - 믹스 reactioN과 스핀 짧게. 37 열 혼합 ° C 5 분.
- 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다
1 단계 샘플 21.0 μl 나트륨 나트륨, 40 MM 2.5 μl AMV 역방향 Trancriptase 30 U μl 1.5 ... 22 U / μl Nuclease 무료로 물 0.0 μl 총 볼륨 25.0 μl - ° C 하이브 리다이 제이션 오븐에서 37에서 1 H에 대한 반응을 품어.
- 얼음 부화 장소 반응 후.
- 0.5 ML PCR 튜브를 타고 추가
- 두 번째 스트랜드 합성 :
- 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다
첫 스트랜드 반응 25.0 μl 둘째 스트랜드 2.5X 버퍼 40.0 μl BSA, 1 MG / ML 5.0 μl DNA 중합 효소 I 23 U 3.0 μl RNase H 0.8 U μl 0.5 ... 1.5 U / μl Nuclease 무료로 물 μl 26.5 총 볼륨 100.0 μl - 튜브를 flicking하여 부드럽게 섞는다. 14에서 반응을 품어 ° thermocycler 2 H를위한 C. ° C 반응 튜브를 추가하기 전에 14 thermocycler를 냉각하는 것이 중요합니다. 반응 ° C 앞이나 반응 중 14 위에 내버려하지 마십시오.
- 반응을 종료하려면, 반응 μg 입력 mRNA 당 T4의 DNA 중합 효소 2 단위를 추가합니다. 14 10 분 품어 ° C.
- 얼음 500 MM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 치료 DEPC 장소 10 μl를 추가하여 반응을 중지합니다.
- 제조 업체의 지시에 따라 EtOH의 석출 또는 Promega 마법사 DNA - 정리 시스템 중 하나를 사용하여 cDNA를 청소합니다. -80에서 보관 샘플 ° C. cDNA 두 번 좌초 직접이 시점에서 pyrosequenced 수 있습니다.
- 다음과 같은 구성 요소를 추가합니다
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Discussion
천연 미생물 커뮤니티에 의해 유전자 발현의 조사 미생물의 생태 역할과 기능을 탐구하는 수단으로 최근 몇 년 동안 일반되었다. 해양 미생물의 감지, 부량, 그리고 특성화와 함께 사용, 유전자 발현의 분석은 자연 미생물 지역 사회에 기능 phylogeny를 연결하는 데 사용할 수 있습니다. 기능성 유전자 발현을 대상으로 많은 기술은 특정 프로브 또는 알려진 일련의 유전자위한 프라이머 세트에 의존하고 있습니다. 대조적으로, 환경 transcriptomics 기존 시퀀스 데이터에 의해 적극적으로 표현되고 그 유전자에 대한 설정을 부과하는 제약없이 유전자 발현을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 환경에서 mRNA 수영장 분석 그러므로 핵심 활동과 그들을 중재 생물 사이의 발견 연결의 가장 효과적인 방법 중 하나를 제공할 수 있습니다.
환경 transcriptomics의 초기 응용 프로그램은 자연 생태계의 3 세균성 mRNA 수영장의 조성과 역학의 첫번째 전망 중 하나를 제공했습니다. 해안 살트 마시 (사펠로 아일랜드, GA)과 알칼리성, hypersaline 호수 (모노 레이크 CA) 모두에서 사본 라이브러리의 표현 유전자 분석은 chitinases 유황과 같은 여러 기능 유전자의 환경 변종을 포함 biogeochemical 관심 유전자 시퀀스를 공개 이러한 생태계의 각 특정되었습니다 산화 유전자. 그것은 또한 가능한 탄소와 질소 원으로 혈관 공장 및 algal - 파생 polyamines의 미생물 열화와 같은 소설, 예상치 못한 프로세스에 대한 증거를 제공했습니다.
분자 기술은 환경 시료에서 RNA와 협력 및 기술 향상 시퀀싱과 관련된 제한 사항을 줄이기 위해 발전으로 환경 transcriptomics 좀 더 널리 사용되는 기술되고 있습니다. 이것은 표면 바다 6 미생물의 기능을 검사하고 동일한 환경에서 7 ~ 밤낮 기능성 유전자 발현을 비교하기 위해 사용되었습니다. 환경 transcriptomics 또한 특정 환경 요인과 biogeochemistry에 미생물 반응의 이해를 확보 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여 발견한 유전자 또는 기능 microarrays 및 정량 PCR 등 유전자 발현보다 양적 연구 대상이 될 수 있습니다.
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Acknowledgments
기금은 고든 무어와 베티 재단 보조금 및 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 MCB - 0702125에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | Qiagen | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre Biotechnologies | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega Corp. | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega Corp. | A7280 |
References
- Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
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- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
