Summary
Bu video 14 günlük fide Arabidopsis dokuları bozulmadan protoplast izole etmek için bir prosedür gösterir. Izole protoplast en az 96h bozulmadan kalır ve bir aylık olgun bitkilerin yerine fide izole olduğunu göz önüne alındığında, bu yordamı sağlam protoplast gerektiren testleri hızlandırır.
Abstract
Protoplast bitki hücrelerinin hücre duvarlarının enzimatik çıkarmıştı. Farklı bitki dokularında protoplast izolasyonu ilk 40 yıldan fazla bir zaman önce bildirilmiştir
Protocol
Bölüm 1. Büyüyen bitkiler için sağlam bir ortamın hazırlanması.
Biz genellikle kültür bitkilerinin konsantre Murasige ve Skoog (MS) orta,% 1 sakkaroz ve% 0.7 agar ile desteklenmiş. Bu bitkilerin sağlıklı tutmak için gerekli tüm maddeler içerir.
MS 1L, medya, pH 5.7 hazırlamak için
- 1.5-2.0L otoklavlanabilir şişede 800 ml su içine 2.15 g MS tozu ekleyin.
- Karıştırma çubuğu şişeye koyun ve karıştırarak plaka orta karıştırma MS tozu çözülür.
- Karıştırma, damla damla, 1N KOH 5.7 MS ortamın pH ayarlamak için.
- 10 g sakaroz, karıştırmaya devam edin.
- 7 g agar ekle *.
- 1000 ml hazırlanan orta son ses seviyesini ayarlayın ve otoklav ile sterilize edin .*
- Karıştırarak bir plaka üzerine yerleştirin orta otoklavlanabilir ve karıştırma süre soğumasını, o agar şişenin dibinde çökelti olmaz. Orta ~ 60 ° C'ye kadar soğutun
- 100 mm Petri kapları dökün. 4 plakaları tutun ° C
* İpucu 1: Agar çözülür teşebbüs etmeyin. Otoklav sırasında çözünür.
İpucu 2: otoklav sırasında bir şişe karıştırma çubuğu tutun, daha sonra ihtiyacınız olacak.
* İpucu 3: otoklavlanmış şişe 10 s ellerinizi Eğer orta yeterince soğutulur ve plakaları dökülmeye başlandı.
Bölüm 2. Bitki materyali ve büyüme koşulları.
- Arabidopsis thaliana tohum sterilize
- 100 mg tohum Eppendorf mikrosantrifüj tüpler içine yerleştirin ve 1 ml% 70 etanol ekleyin. İyice karıştırın ve 2 dakika boyunca inkübe edin. , Tohumlar Spin süpernatantı aspire.
- 1 ml% 1.8 çamaşır suyu çözeltisi *% 0.1 Tween-20 içeren. 10 dakika karıştırın. Tohum ve aspirat çamaşır suyu çözeltisi aşağı spin.
- Bu adım, bir laminer akış kaputu yapılmalıdır. Tohum için 1 ml steril su ekleyin, iyice karıştırın. Su aspire, tohumlar aşağı Spin. Bu adımı 5 kere tekrarlayın.
- Adım 1 tabak (100 tohum / plaka) hazırlanan üzerine tohumlarını yaymak.
- 24-48 saat boyunca 4 numaralı seribaşı plakaları tutun ° C tabakalaşma için karanlık.
- 23/19 ° C açık / koyu sıcaklık rejimi büyüme odasında 14 gün 8 saat light/16 h koyu fotoperiyodun (250 mmol m -2 s -1 fotosentetik bir foton akı yoğunluğu) ile bitkilerin büyümesi ve% 75 bağıl nem.
İpucu 1: Bleach çözüm seyreltme bir ev Clorox,% 6 oranında sodyum hipoklorit içeren ve bir final konsantrasyon% 0.1 Tween-20 ekleyerek.
Bölüm 3. Arabidopsis fidecilikten protoplast izolasyonu.
- Dilim 2 filtre ile sterilize edilmiş TVL Çözüm 15 ml taze bir jilet ile 14 günlük fide gr. Biz tek kullanımlık steril Petri kutularına bitki materyali doğrayın.
- 200 ml beher içine doğranmış dokuların Transferi, filtre ile sterilize edilmiş Enzim Çözüm girdap Enzim Çözümü ile dokuların karışımı, parafilm ve alüminyum folyo ile kaplayın izin beher 20 ml ekleyin.
- 16-18 saat boyunca karanlıkta, oda sıcaklığında 35 dak bitki dokularında çalkalayınız
- 50 ml Falcon tüp içine peynir bez 8 kat, W5 Çözüm öncesi ıslak üzerinden eleme yayımlanan protoplast toplayın.
- W5 Çözüm 15 ml bez yıkama peynir bez bir kez daha Elek protoplast.
- Bindirme protoplast dikkatlice W5 Çözüm 10 ml, şeker degrade, kimseyi rahatsız etmeyecek; santrifüj 7 dk 100 g.
- Enzim Çözüm ve W5 Çözümü (Şekil 1B) arayüzü protoplast 10 ml toplayın ve yeni bir 50 ml Falcon tüp transferi.
- 60 gr az 5 dakika için 15 ml W5 Çözüm, santrifüj Süpernatantı.
- 60 g 5min Enzim Çözüm Çözüm, santrifüj 15ml W5 protoplast resuspending ücretsiz protoplast yıkayın
- 1-3ml W5 Çözüm supernatant, tekrar süspansiyon pelet protoplast çıkarın.
- Bir hemasitometre ile hücre sayımı protoplast verim değerlendirin.
Bölüm 4. Reaktifler:
TVL: sorbitol 0.3 M, 50 mM CaCl 2 Filtre sterilize ve -20 depolamak ° C
Enzim Çözüm: 0.5 M sakkaroz, 10 mM MES-KOH [pH 5.7, 20 mM CaCl 2, 40 mM KCl,% 1 selülaz (Onozuka R-10),% 1 Macerozyme (R10). Filtre sterilize ve taze olarak kullanabilirsiniz.
W5 Çözüm:% 0.1 (w / v) glikoz,% 0,08 (w / v) KCl,% 0.9 (w / v) NaCl,% 1,84 (w / v) CaCl 2, 2 mM MES-KOH pH 5.7. Filtre sterilize ve oda sıcaklığında muhafaza.
Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları:
Bölüm 1 ve 2 olarak açıklanan Arabidopsis kültür koşulları kullanarak sağlıklı fide, protoplast (Şekil 1A) izole etmek için uygun hale getirir. Protoplast sakaroz yoğunluk farkı görülmektedir saflaştırılmışent santrifüj ve W5 ve Enzim çözümleri (Şekil 1B) arayüzü toplanır. Bölüm 3'te açıklanan protoplast izolasyon prosedürü kullanarak tipik bir gram taze fide sağlam protoplast 5-10 10 6 (Şekil 1C) hasat.
Şekil 1. Arabidopsis fidecilikten protoplast izolasyonu. A, Dokular Arabidopsis, 14 günlük fide değiştirilmiş bir yordam (Chen ve Halkier, 2000) tarafından toplanan ve protoplast dönüştürülür. B, protoplast sakaroz yoğunluk gradiyenti santrifüj saflaştırılmış ve enzim çözeltisi arayüz toplanır. W5 uffer (Beyaz oklar). C, protoplast Parlak alan mikroskobu. Microphotographs Zeiss Axioscope 2 artı mikroskop ile arabirim soğutmalı bir CCD kamera kullanılarak toplanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sağlıklı bitkiler ile sağlam protoplast yüksek verim sağlamak için start-up için çok önemlidir. Protoplast izole etmek için, filtre sterilize çözümleri kullanın. Protoplast kırılgan olduğunu unutmayın. Bu nedenle, protoplast ele pipetlemeyin veya onları fren şiddetle beri girdap onları karıştırmak yok. Bunun yerine, yavaş yavaş dönen veya santrifüj tüpüne taping protoplast karıştırın. En az 96 saat boyunca canlı açıklanan prosedür verim sağlam protoplast Bu nedenle, protoplast hücre içi proteinler lokalizasyonu, izolasyon ve sağlam organel ve çift iplikli RNA enterferans (RNAi), 3-5 vb gen inaktivasyonu hedeflenen analizleri gibi hücresel süreçleri, bir dizi çalışma için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Teknoloji Enterprise ve Ticarileştirme için Cornell Merkezi (CCTEC), Haziran 2008 ile bitki genlerinin fonksiyonel analizlerde kullanmak için bu yordamı açıklayan geçici patent davaları açmışlardır. Tamam Vatamaniuk, Zhai, bitki genlerinin hızlı fonksiyonel analizler için Z. Yöntemi: Hulasa yok 50341/015001.
Acknowledgments
Bu çalışma, Start-Up Hibe OKV verilen, Cornell Üniversitesi Ziraat Deney İstasyonu (CUAES) NYC-125.433 Hatch Grant ve Cornell tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MurashigeandSkoogBasalSaltMixture(MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| PetriDishes(100x15mm) | Krackeler Scientific, Inc. | 82-4001 | |
| Cellulase(OnozukaR‐10) | Research Products International Corp. | C32200 | |
| Macerozyme(R10) | Research Products International Corp. | M22010 | |
| Cheeseclothwipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | |
| LabRotator | Fisher Scientific | 1167152Q | |
| AllegraX‐15RCentrifuge | VWR international | 392932 | |
| Axioskop2PlusMicroscope | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
