Summary
Deze video toont een procedure voor het isoleren van intacte protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis. Gezien het feit dat de geïsoleerde protoplasten intact blijven gedurende minstens 96 uur en worden geïsoleerd van zaailingen in plaats van een-maand-oude volwassen planten, deze procedure versnelt assays die intact protoplasten.
Abstract
Protoplasten zijn plantaardige cellen die hebben hun celwanden enzymatisch verwijderd. Isolatie van protoplasten van verschillende weefsels plant werd voor het eerst meer dan 40 jaar geleden gemeld
Protocol
Deel 1. Bereiding van vaste medium voor het kweken van planten.
We meestal cultuur planten op geconcentreerd Murasige en Skoog (MS) medium, aangevuld met 1% sucrose en 0,7% agar. Het bevat alle noodzakelijke ingrediënten om planten gezond te houden.
Ter voorbereiding van 1L van MS, media pH 5,7
- Voeg 2,15 g van MS poeder in 800 ml water in 1.5-2.0L autoclaveerbaar fles.
- Plaats een roerstaaf in de fles en los MS poeder door roeren medium op een bewogen plaat.
- Al roerend, toe te voegen, druppel voor druppel, 1N KOH om de pH van MS medium aan te passen naar 5,7.
- Voeg 10 g sucrose, blijf roeren.
- Voeg 7 g agar *.
- Pas het uiteindelijke volume van de bereide medium tot 1000 ml en steriliseer in de autoclaaf .*
- Plaats geautoclaveerd medium op een bord en roeren afkoelen tijdens het roeren, zodat de agar niet neerslaan op de bodem van de fles. Afkoelen middellange tot ~ 60 ° C. *
- Giet 100 mm Petri platen. Houd platen bij 4 ° C.
* Tip 1: Probeer niet om agar op te lossen. Het zal solubiliseren tijdens de autoclaaf.
* Tip 2: Houd de roeren bar in een fles tijdens de autoclaaf, zul je later nodig hebt.
* Tip 3: Als je je handen op de geautoclaveerde fles voor 10 s, betekent dit dat het medium voldoende is afgekoeld en je kunt beginnen gieten platen.
Deel 2. Plantmateriaal en groeiomstandigheden.
- Steriliseren zaden van Arabidopsis thaliana
- Plaats 100 mg van de zaden in Eppendorf microcentrifugebuizen en voeg 1 ml 70% ethanol. Meng goed en incubeer gedurende 2 minuten. Spin zaden naar beneden, aspireer het supernatant.
- Voeg 1 ml van 1,8% bleekwater-oplossing * die 0,1% Tween-20. Mix voor 10 minuten. Spin down zaden en aspireer bleekwater oplossing.
- Deze stap moet worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap. Voeg 1 ml steriel water om zaden, goed mengen. Spin down zaden, zuigen water. Herhaal deze stap 5 keer.
- Verspreid zaden op de bereid in stap 1 platen (100 zaden / plaat).
- Houden geplaatste platen voor 24-48 uur bij 4 ° C in het donker voor de stratificatie.
- Kweek planten voor 14 dagen in de groei van kamer met 8 uur light/16 uur donker lichtperiode (bij een fotosynthetische foton flux dichtheid van 250 mol m -2 s -1) op 23 / 19 ° C licht / donker temperatuur wordt geregeld, en 75% relatieve vochtigheid.
* Tip 1: Bleach oplossing is verzonnen door verdunning een huishouden Clorox, met 6% natriumhypochloriet en het toevoegen van Tween-20 tot een uiteindelijke concentratie van 0,1%.
Deel 3. Isolatie van protoplasten van Arabidopsis zaailingen.
- Snijd 2 g van 14-dagen-oude zaailingen met een vers scheermesje in 15 ml van een filter-gesteriliseerd TVL Solution. We hakken plantmateriaal in een steriele wegwerp petrischalen.
- Overdracht gehakt weefsels in 200 ml bekerglas, voeg 20 ml van een filter-gesteriliseerd enzymoplossing, draai de beker te laten weefsels mengen met Enzyme Solution, dek af met parafilm en aluminiumfolie.
- Schud plantenweefsels op 35 toeren per minuut in het donker bij kamertemperatuur gedurende 16 tot 18 uur
- Verzamel de vrijgekomen protoplasten in 50 ml Falcon buis door zeven tot en met 8 lagen van de kaasdoek, pre-nat in W5 Solution.
- Zeef protoplasten van de kaas-doek nog een keer door het wassen van de doek met 15 ml W5 Solution.
- Zorgvuldig overlay protoplasten met 10 ml W5 Solution, niet storen de suiker gradiënt, centrifuge voor 7 minuten bij 100 g.
- Verzamel 10 ml van protoplasten op het snijvlak van enzymoplossing en W5 Solution (Fig. 1B) en over te dragen aan een nieuwe 50 ml Falcon buis.
- Voeg 15 ml W5 Solution, centrifuge gedurende 5 minuten bij 60 g. Verwijder het supernatant.
- Was protoplasten vrij van enzymoplossing door resuspenderen protoplasten in 15 ml van de W5 Solution, centrifuge voor 5 min op 60 g
- Verwijder de bovenstaande vloeistof, hersuspenderen gepelleteerde protoplasten in 1-3 ml W5 Solution.
- Evalueer protoplast opbrengst door de cel tellen met een hemocytometer.
Deel 4. Reagentia:
TVL: 0.3 M sorbitol; 50 mM CaCl 2 Filter-steriliseer en bewaar bij -20 ° C.
Enzyme Oplossing: 0,5 M sucrose, 10 mM MES-KOH [pH 5,7], 20 mM CaCl2, 40 mM KCl, 1% Cellulase (Onozuka R-10), 1% Macerozyme (R10). Filter-steriliseren en vers te gebruiken.
W5 Oplossing: 0,1% (w / v) glucose, 0,08% (w / v) KCl, 0,9% (w / v) NaCl, 1,84% (w / v) CaCl 2, 2 mM MES-KOH pH 5,7. Filter-steriliseer en bewaar bij kamertemperatuur.
Deel 5: representatieve resultaten:
Met behulp van Arabidopsis kweekomstandigheden zoals beschreven in deel 1 en 2 maakt gezonde zaailingen, geschikt voor het isoleren van protoplasten (Fig. 1A). Protoplast worden gezuiverd door sucrose dichtheid GradiENT centrifugeren en verzameld op het snijvlak van W5 en Enzyme oplossingen (Fig. 1B). Met behulp van protoplast isolatie procedure zoals beschreven in deel 3 hebben we normaal gesproken de oogst 05 tot 10 oktober 6 van intact protoplasten (Fig. 1C) van een gram verse zaailingen.
Figuur 1. Isolatie van protoplasten van Arabidopsis zaailingen. A, Weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis werden verzameld en omgezet in protoplasten door een aangepaste procedure van (Chen en Halkier, 2000). B, werden Protoplasten gezuiverd door sucrose dichtheidsgradiënt centrifugatie en verzameld op het snijvlak van enzym-oplossing en W5 uffer (witte pijlen). C, Bright-veld microscopie van protoplasten. Microfoto's werden verzameld met behulp van een gekoelde CCD camera gekoppeld aan de Zeiss Axioscope 2 plus microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om ervoor te zorgen de hoge opbrengst van intacte protoplast is het heel belangrijk om weer te beginnen met gezonde planten. Gebruik filter-steriliseren-oplossingen voor het isoleren van protoplasten. Vergeet niet dat protoplasten kwetsbaar zijn. Daarom, wanneer u protoplasten hanteren, niet mengen, pipet of vortex ze krachtig, omdat het hen zal remmen. In plaats daarvan, mix protoplasten door langzaam draaiende of taping de centrifugebuis. De beschreven procedure opbrengst intact protoplasten die levensvatbaar zijn voor ten minste 96 uur Daarom kan protoplasten worden gebruikt om een verscheidenheid van cellulaire processen, zoals subcellulaire lokalisatie van eiwitten, isolatie en analyse van intacte organellen en gerichte gen-inactivatie door double-stranded RNA-interferentie (RNAi), enz. 3-5 studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De voorlopige patent beschrijft deze procedure voor gebruik ervan in functionele analyses van plantaardige genen zijn gedeponeerd bij Cornell Centrum voor Technologie Enterprise en commercialisering (CCTEC), juni 2008. Docket Geen 50341/015001: Vatamaniuk, OK, en Zhai, Z. methode voor een snelle functionele analyses van plantaardige genen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Cornell University Agricultural Experiment Station (CUAES) NYC-125433 Hatch Grant en Cornell Start-Up Grant toegekend aan OKV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MurashigeandSkoogBasalSaltMixture(MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| PetriDishes(100x15mm) | Krackeler Scientific, Inc. | 82-4001 | |
| Cellulase(OnozukaR‐10) | Research Products International Corp. | C32200 | |
| Macerozyme(R10) | Research Products International Corp. | M22010 | |
| Cheeseclothwipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | |
| LabRotator | Fisher Scientific | 1167152Q | |
| AllegraX‐15RCentrifuge | VWR international | 392932 | |
| Axioskop2PlusMicroscope | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
