Summary
이 동영상은 Arabidopsis 14 일 된 모종의 조직에서 그대로 protoplasts를 분리하는 절차를 보여줍니다. 격리 protoplasts 적어도 96h 위해 그대로 유지하고 대신 한 달 된 성숙한 식물의 모종으로부터 격리되는 감안할 때,이 절차는 그대로 protoplasts가 필요한 assays을 신속.
Abstract
Protoplasts 자신의 세포 벽을 제거 효소가 있었 식물의 세포 수 있습니다. 다른 식물의 조직에서 protoplasts의 분리가 먼저 40 년 이상 전에보고되었다
Protocol
1 부. 성장 식물 고체 매체의 준비.
우리는 일반적으로 집중 Murasige와 Skoog (MS) 매체에 문화 공장 1 % 자당 및 0.7 %의 한천과 함께 보충. 그것은 식물이 건강하게 유지하는 필요한 모든 재료가 포함되어 있습니다.
MS의 1L, 미디어 산도 5.7 준비
- 1.5 2.0L autoclavable 병에 물 800 ML에 MS 분말 2.15 g을 추가합니다.
- 병에 감동 막대를 삽입하고 감동 접시에 매체를 교반하여 MS 분말을 풀다.
- 교반하는 동안, 추가 드롭 들러, 1N 코는 5.7으로 MS 매체의 산도를 조정합니다.
- 자당의 10g를 추가, 감동 유지.
- 한천의 7g 추가 *.
- 1000 ML에 준비 매체의 최종 볼륨을 조정하고 autoclaving하여 소독 .*
- 장소 감동 접시에 매체를 autoclaved하고 교반하면서 그것을 진정 그 한천은 병의 바닥에 침전되지 않습니다. ~ 60 ° C. *로 매체를 쿨
- 100mm 페트리 접시에 붓고. 4 접시 보관 ° C.
* 팁 1 : 한천을 분해하지 마십시오. 그것은 autoclaving 동안 solubilize 것입니다.
* 팁 2 : autoclaving 동안 병에 교반 막대를 유지하는데, 나중에 필요합니다.
* 팁 3 : 10 s에 대한 autoclaved 병에 손을 유지할 수있다면, 그것은 매체 충분히 식었 당신이 접시를 따르고 시작할 수있다는 것을 의미합니다.
2 부. 식물과 성장 조건.
- Arabidopsis thaliana의 씨앗을 소독
- eppendorf의 microcentrifuge 튜브에 씨앗 100 MG를 삽입하고 70 % 에탄올 1 ML를 추가합니다. 잘 믹스 2 분 알을 품다. , 씨앗을 스핀 다운 뜨는을 대기음.
- 1.8 %의 표백제 용액 1 ML 추가 * 0.1 % 트윈 - 20를 포함. 10 분 섞는다. 종자 및 대기음 표백 용액을 스핀.
- 이 단계는 층류 후드에서 수행되어야한다. 씨앗을 멸균 물 1 ML 추가, 잘 섞는다. 물을 기음, 씨앗을 스핀. 이 단계에게 5 회 반복합니다.
- 1 단계 접시 (100 씨앗 / 플레이트)의 준비에 씨앗을 퍼뜨린다.
- 4 24-48 H에 대한 씨앗을 품고 번호판을 계속 ° 충화 동안 짙은 어둠 속에서 C.
- 19분의 23 ° C 빛 / 어둠의 온도 정권 8 H light/16 H 어두운 photoperiod (250 μmol m -2 S -1의 광합성 광자 선속 밀도에서)와 함께 성장 챔버에서 14 일 동안 식물을 성장하고 75 % 상대 습도.
* 팁 1 : 블리치 솔루션 지어낸입니다 희석 가정 Clorox하여 6 % 나트륨 차아 염소 산염을 포함하고 0.1 %의 최종 농도 트윈 - 20를 추가.
부 3. Arabidopsis 모종의 protoplasts의 고립.
- 슬라이스 필터 - 살균 TVL 솔루션의 15 ML에 신선한 면도날로 14 일 된 모종의 2g. 우리는 일회용 멸균 배양 접시에 식물 자료를 들어온다.
- 200 ML의 비커에 잘게 조직을 전송, 필터 살균 효소 솔루션, 소용돌이 효소 솔루션으로 조직 믹스가 parafilm 및 알루미늄 호일로 커버하도록 비커 20 ML를 추가합니다.
- 16-18 H. 위해 상온에서 어두운 35 RPM에서 식물 조직 쉐이크
- 치즈 천 8 층, W5 용액에 미리 서부 유럽 표준시를 통해 거를 50 ML 팔콘 튜브에 공개 protoplasts를 수집합니다.
- W5 솔루션의 15 ML과 천을 세탁하여 치즈 천으로 한 번 더에서 체의 protoplasts.
- 조심스럽게 W5 솔루션의 10 ML과 오버레이 protoplasts은 설탕 기울기를 방해하지, 원심 분리기를 100 7 분, G.위한
- 효소 솔루션 및 W5 솔루션 (그림의 1B)의 인터페이스에서 protoplasts 10 ML를 수집하고 새로운 50 ML 팔콘 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 60 G.에서 5 분 15 ML W5 솔루션, 원심 분리기 추가 뜨는을 제거합니다.
- 60g에서 5 분 대한 15ml W5의 솔루션, 원심 분리기에 protoplasts을 resuspending하여 효소 솔루션에서 무료 protoplasts 와시
- 1 - 3ml W5 솔루션에 뜨는, resuspend pelleted protoplasts를 제거합니다.
- hemocytometer로 계산하여 세포 원형질의 수율을 평가해보십시오.
부 4. 시약 :
TVL : sorbitol 0.3 M, 50 MM CaCL이 필터 - 소독 및 -20 ° C.에 저장
효소 솔루션 : 0.5 M의 자당, 10 MM MES - 코 [산도 5.7], 20 MM CaCl 2, 40 MM KCl, 1 % Cellulase (Onozuka R - 10), 1 %의 Macerozyme (R10). 필터 - 소독과 갓 사용합니다.
W5 솔루션 : 0.1 % (W / V) 포도당, 0.08 % (W / V) KCl, 0.9 % (W / V) NaCl, 1.84 % (W / V) CaCl 2, 2 MM MES - 코 산도 5.7. 필터 - 소독하고 실온에서 저장합니다.
제 5 부 : 대표 결과 :
부품 1과 2에서 설명한 Arabidopsis 문화 조건을 사용하면 protoplasts (그림 1A)을 분리에 적합한 건강한 모종을 렌더링. 원형질은 자당 농도 그라디에 의해 정화 아르엔트 원심 분리 및 W5 및 효소 솔루션 (그림의 1B)의 인터페이스에서 수집했습니다. 제 3에 설명되어있는 원형질 분리 절차를 사용하여 우리는 일반적으로 신선한 모종 중 하나 그램에서 그대로 protoplasts의 10월 5일부터 10일까지 6 (그림 1C)를 수확.
그림 1. Arabidopsis 모종의 protoplasts의 고립. A, Arabidopsis 14 일 된 모종의 조직가의 수정 절차 (첸과 Halkier, 2000)이 수집하여 protoplasts로 변환되었습니다. B, Protoplasts은 자당 밀도 기울기 원심 분리에 의해 정화 및 효소 솔루션의 인터페이스에서 수집되었습니다 W5 uffer (화이트 화살표). C, protoplasts의 브라이트 - 필드 현미경. Microphotographs은 자이스 혈구 Axioscope이 플러스 현미경으로 연계 냉각 CCD 카메라를 사용하여 수집되었습니다.
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Discussion
그대로 원형질의 높은 수율을 보장하기 위해서는 건강 식물 - 시작하는 것은 매우 중요하다. protoplasts를 분리 위해 필터 소독 솔루션을 사용합니다. protoplasts가되기 것을 기억하십시오. 따라서 protoplasts을 처리하는 경우, pipet 또는 그들을 브레이크 것입 적극적으로부터 와동을 혼합하지 않습니다. 대신 천천히 회전 또는 원심 튜브를 녹화하여 protoplasts를 섞는다. 적어도 96 H.에 대한 가능한 설명하는 절차는 수율 그대로 protoplasts 따라서, protoplasts 그러한 subcellular 단백질 현지화, 절연 및 손상 organelles 두 번 좌초 RNA 간섭 (RNAi) 등 3-5으로 유전자 불활 성화 타겟의 분석으로 세포 프로세스의 다양한 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
식물 유전자의 기능 분석에의 이용에 대해이 절차를 설명 잠정 특허는 기술 기업 및 상용화에 대한 코넬 센터 (CCTEC) 월 2008 접수되었습니다. OK Vatamaniuk, 그리고 Zhai, 식물 유전자의 기능 분석에 대한 신속한 Z. 방법 : 내용 적요 대한 50341/015001 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 시작 그랜트 OKV에게 수여 코넬 대학 농업 실험 스테이션 (CUAES) NYC - 125433 해치 그랜트와 코넬에서 지원했습니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MurashigeandSkoogBasalSaltMixture(MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| PetriDishes(100x15mm) | Krackeler Scientific, Inc. | 82-4001 | |
| Cellulase(OnozukaR‐10) | Research Products International Corp. | C32200 | |
| Macerozyme(R10) | Research Products International Corp. | M22010 | |
| Cheeseclothwipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | |
| LabRotator | Fisher Scientific | 1167152Q | |
| AllegraX‐15RCentrifuge | VWR international | 392932 | |
| Axioskop2PlusMicroscope | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
