Summary
このビデオでは、シロイヌナズナの14日齢の実生の組織から無傷のプロトプラストを単離するための手順を示しています。分離されたプロトプラストは、少なくとも96時間のためにそのまま残るし、代わりに一ヶ月の成熟植物の苗から分離されていることを考えると、この手順は、無傷プロトプラストを必要とするアッセイを迅速に処理されます。
Abstract
プロトプラストは細胞壁が酵素的に除去あった植物細胞である。異なる植物組織からのプロトプラストの単離は、最初の40年以上前に報告された
Protocol
パート1。植物栽培用固形培地の調製。
集中Murasigeと1％ショ糖および0.7％寒天を添加したスクーグ（MS）培地上で我々は通常、カルチャの植物。それは植物が健康を保つために必要なすべての成分が含まれています。
MSの1L、メディアのpH 5.7調製するための
- 1.5 - 2.0Lオートクレーブ可能なボトルに水800mlにMSの粉末2.15gを追加します。
- ボトルに攪拌棒を配置し、攪拌プレート上で培地を攪拌することにより、MSパウダーを溶かす。
- 撹拌しながら、5.7にMS培地のpHを調整するために、滴、1N KOHを加える。
- ショ糖10 gを追加し、攪拌してください。
- 寒天7gを追加*
- 1000 mlに調製した培地の最終的な音量を調整し、オートクレーブで滅菌.*
- 場所は、攪拌プレート上で培地をオートクレーブ処理し、攪拌しながら、それを冷ます、その寒天が瓶の底に沈殿しないように。 〜60℃*に培地を冷やす
- 100ミリメートルペトリ皿に注ぐ。 4でプレートを保つ℃に
*ヒント1：寒天を溶解しようとしないでください。それは、オートクレーブ中に可溶化されます。
*ヒント2：オートクレーブ中に瓶の中に攪拌棒を保つには、後で必要になります。
*ヒント3：あなたが10秒間高圧蒸気滅菌瓶にあなたの手を保つことができるなら、それは媒体が十分冷えてからして、プレートを注いで開始できることを意味します。
パート2。植物材料と成長条件。
- シロイヌナズナの種子を滅菌
- エッペンドルフ微量遠心チューブに種子100 mgを置き、70％エタノール1 mlを加える。よく混和して、2分間インキュベートする。 、種をスピンダウンし、上清を吸引除去する。
- 1.8％漂白剤溶液1mlを追加* 0.1％Tween - 20を含む。 10分間混ぜる。種子や吸引漂白剤溶液をスピンダウン。
- このステップでは、層流フードで行う必要があります。種に滅菌水1 mlを追加、よく混ぜる。水を吸引、種子をスピンダウン。このステップを5回繰り返します。
- ステップ1プレート（100粒/プレート）で調製に種を広げる。
- 4℃で24〜48時間のためにシードのプレートを保持°層別化のための暗所で。
- 19分の23 ° Cの明/暗、温度体制で8時間light/16時間暗光周期（250マイクロモル、M -2 s -1の光合成光量子束密度時）で生育チャンバー内で14日間の植物を育て、75％の相対湿度。
*ヒント1：ブリーチ溶液を6％の次亜塩素酸ナトリウムを含む、0.1％の最終濃度にTween - 20を追加して、希釈家庭クロロックスがアップされています。
第3部。 シロイヌナズナ実生からのプロトプラストの単離。
- 濾過滅菌TVL溶液15mlで新鮮なカミソリの刃と14日齢の実生のスライス2グラム。我々は、無菌使い捨てペトリ皿に植物材料を切る。
- 200mlのビーカーに刻んだ組織を転送する、フィルター滅菌した酵素液、スワール酵素溶液で組織のミックスは、パラフィルムとアルミ箔でカバーできるようにビーカーの20mlを加える。
- 16〜18時間室温で暗所で35 rpmで植物組織を振る
- チーズクロスの8層、W5ソリューションのプリウェットを通してふるいに50 mlのFalconチューブ中に放出されたプロトプラストを集める。
- W5溶液15mlで布を洗浄することによりチーズクロスつのより多くの時間からふるいプロトプラスト。
- 糖勾配を乱さないように、W5溶液の10mlでプロトプラストを慎重にオーバーレイ、100 gで7分間遠
- 酵素液とW5ソリューション（図1B）の界面でのプロトプラストの10mlを収集し、新しい50 mlのFalconチューブに移す。
- 15ミリリットルW5溶液、60 gで5分間遠心分離を追加します。上清を取り除く。
- 60グラムで5分間遠、W5溶液の15ミリリットルでプロトプラストを懸濁することにより、酵素液から遊離プロトプラストを洗う
- 1〜3ミリリットルW5溶液の上清、再懸濁しますペレットプロトプラストを削除します。
- 血球計でカウント細胞によるプロトプラストの収量を評価する。
パート4。試薬：
TVL：0.3 Mソルビトール、50mMのCaCl 2をフィルター滅菌し、-20℃で保存します。
酵素溶液：0.5 Mのショ糖、10mMのMES - KOH [pHを5.7]、20mMのCaCl 2を 、40mMのKClを、1％セルラーゼ（小野塚R - 10）、1％Macerozyme（R10）。フィルター滅菌し、新鮮な使用。
W5解決策：0.1％（w / v）のグルコース、0.08％（w / v）の塩化カリウム、0.9％（w / v）の塩化ナトリウム、1.84％（w / v）のCaCl 2を 、2mMのMES - KOH pHは5.7。ろ過滅菌し、室温で保管してください。
パート5：代表的な結果：
パート1および2で説明したシロイヌナズナ培養条件を使用すると、プロトプラスト（図1A）を単離するのに適した健康な苗を、レンダリングします。プロトプラストは、ショ糖密度グラジエントによって精製されていますENTの遠心分離とW5と酵素のソリューション（図1B）のインターフェースで収集。第3部で説明したプロトプラストの単離法を用いて、我々は一般的に新鮮な苗1グラムから無傷のプロトプラストの5-10 10 6（図1C）を収穫。
図1。シロイヌナズナ実生からのプロトプラストの単離。 、シロイヌナズナの14日齢の実生からの組織が あるのは、変更手続き（チェンとHalkier、2000）によって収集し、プロトプラストに変換された。B、プロトプラストは、ショ糖密度勾配遠心法により精製し、酵素液の界面で収集していたW5 uffer（ 白矢印 ）。C、プロトプラストの明視野顕微鏡。顕微鏡はツァイスのAxioscope 2に加え、顕微鏡とインタフェース冷却CCDカメラを用いて収集した。
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Discussion
無傷のプロトプラストを高収率を確保するためには、健康な植物で、起動に非常に重要です。プロトプラストを単離するための溶液をろ過滅菌して使用してください。プロトプラストが壊れやすいことに注意してください。したがって、プロトプラストを処理する際に、ピペットまたはそれはそれらを制動される精力的に以来、渦、それらを混在させないでください。代わりに、徐々に遠心分離管を回転させたり、テープでプロトプラストを混ぜ合わせる。説明する手順は、少なくとも96時間のための実行可能な無傷プロトプラストを得るしたがって、プロトプラストを二本鎖RNA干渉（RNAi）など3月5日で細胞のような蛋白質の細胞内局在などのプロセス、分離および無傷の細胞小器官と遺伝子不活性化ターゲットの様々な分析を研究するために使用することができます。
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Disclosures
植物遺伝子の機能解析で、その使用のためにこの手順を記述した仮特許は、技術企業と商業化コーネルセンター（CCTEC）、2008年6月に提出されています。レシートは50341/015001ない：Vatamaniuk、[OK]を、そして斎、植物遺伝子の迅速な機能解析のためのZ.方法。
Acknowledgments
この作品は、スタートアップ助成金は、OKVに授与コーネル大学農業試験場（CUAES）NYC - 125433ハッチグラントとコーネルによってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MurashigeandSkoogBasalSaltMixture(MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| PetriDishes(100x15mm) | Krackeler Scientific, Inc. | 82-4001 | |
| Cellulase(OnozukaR‐10) | Research Products International Corp. | C32200 | |
| Macerozyme(R10) | Research Products International Corp. | M22010 | |
| Cheeseclothwipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | |
| LabRotator | Fisher Scientific | 1167152Q | |
| AllegraX‐15RCentrifuge | VWR international | 392932 | |
| Axioskop2PlusMicroscope | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
