Este video muestra un procedimiento para aislar protoplastos intactos los tejidos de 14 días de edad, las plántulas de Arabidopsis. Dado que los protoplastos aislados permanecen intactos por lo menos durante 96 horas y están aislados de plantas en vez de un mes de edad, las plantas adultas, este procedimiento acelera pruebas que requieren protoplastos intactos.
Abstract
Los protoplastos son células vegetales que han tenido sus paredes celulares enzimáticamente eliminado. El aislamiento de protoplastos a partir de tejidos de plantas se registró por primera vez hace más de 40 años<sup> 1</sup> Y desde entonces ha sido adaptado para el estudio de una variedad de procesos celulares, tales como la localización subcelular de las proteínas, el aislamiento de los orgánulos intactos y de genes diana de la inactivación de doble cadena de ARN de interferencia (RNAi)<sup> 2.5</sup>. La mayoría de los protocolos de aislamiento de protoplastos utilizar tejidos de las hojas de Arabidopsis maduros (por ejemplo, 35 días de edad las plantas)<sup> 2.4</sup>. Hemos modificado los protocolos existentes mediante el empleo de 14 días de edad plántulas de Arabidopsis. En este procedimiento, un programa de 14 días de edad plántulas produjeron 5 10<sup> 6</sup> -10<sup> 7</sup> Protoplastos que permanecen intactos por lo menos 96 horas. El rendimiento de protoplastos de plantas es comparable con los preparativos de las hojas de Arabidopsis madura, pero en lugar de 35 a 36 días, el aislamiento de protoplastos se completa en 15 días. Esto permite disminuir el tiempo y el espacio de cámara de crecimiento que se requieren para el aislamiento de protoplastos de plantas adultas cuando se utilizan, y acelera los estudios posteriores que requieren protoplastos intactos.
Protocol
Parte 1. Preparación de un medio sólido para el cultivo de plantas. Por lo general las plantas de la cultura en el concentrado Murasige y Skoog (MS) suplementado con 1% de sacarosa y 0,7% de agar. Contiene todos los ingredientes necesarios para mantener las plantas sanas. Para preparar 1 litro de MS, el pH 5,7 Añadir 2,15 g de MS polvo en 800 ml de agua en botella de 2,0 litros de 1,5 autoclavable. Coloque una barra de agi…
Discussion
Para asegurar el alto rendimiento de protoplastos intactos, es muy importante para la puesta en marcha de las plantas sanas. Use un filtro a esterilizar soluciones para el aislamiento de protoplastos. Recuerde que los protoplastos son frágiles. Por lo tanto, cuando usted está manejando protoplastos, no se mezclan, pipeta o vortex vigorosamente ya que les freno. En cambio, la mezcla protoplastos girando lentamente o grabar el tubo de centrífuga. El procedimiento descrito protoplastos intactos rendimiento que son viabl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Estación Experimental Agrícola de la Universidad de Cornell (CUAES) NYC-125433 Hatch Grant y Cornell subvención inicial concedida a OKV
Zhai, Z., Jung, H., Vatamaniuk, O. K. Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (30), e1149, doi:10.3791/1149 (2009).