Summary
Denna video visar ett förfarande för att isolera intakt protoplasts från vävnader i 14-dagar gamla plantor av Arabidopsis. Med tanke på att den isolerade protoplasts förblir intakta i minst 96h och är isolerade från plantor i stället för en månader gamla mogna anläggningar, påskyndar denna procedur analyser som kräver intakt protoplasts.
Abstract
Protoplasts är växtceller som har fått sina cellväggar enzymatiskt bort. Isolering av protoplasts från olika plantvävnader rapporterades första gången mer än 40 år sedan
Protocol
Del 1. Beredning av fast medium för odling av växter.
Vi brukar kultur växter på koncentrerad Murasige och Skoog (MS) medium kompletterad med 1% sackaros och 0,7% agar. Den innehåller alla nödvändiga ingredienser för att hålla växterna friska.
För att förbereda 1L av MS, media pH 5,7
- Tillsätt 2,15 g MS pulver i 800 ml vatten i 1,5-2.0L autoklaverbara flaska.
- Placera en omrörning bar i flaskan och lös MS pulver under omrörning medium på ett omrörning tallrik.
- Under omrörning, lägg till, droppvis, med 1N KOH justera pH på MS medellång till 5,7.
- Tillsätt 10 g sackaros, under omrörning.
- Tillsätt 7 g agar *.
- Justera den slutliga volymen av medium som bereds till 1000 ml och sterilisera i autoklav .*
- Placera autoklaveras medium på ett omrörning tallrik och kyla ner den under omrörning så att agar inte kommer fällningen vid botten av flaskan. Kyl ner medellång till ~ 60 ° C. *
- Häll 100 mm Petri plattor. Håll plattorna vid 4 ° C.
* Tips 1: Försök inte att lösa agar. Det kommer att löses under autoklavering.
* Tips 2: Håll omrörning baren i en flaska under autoklavering, du kommer behöva det senare.
* Tips 3: Om du kan hålla dig händerna på autoklaveras flaskan under 10 s, betyder det att mediet har kylts ned tillräckligt och du kan börja hälla plattor.
Del 2. Växtmaterial och villkor tillväxt.
- Sterilisera frön av Arabidopsis thaliana
- Plats 100 mg frön i Eppendorf mikrocentrifugrör och tillsätt 1 ml 70% etanol. Blanda väl och inkubera i 2 min. Spin frön ner, aspirera supernatanten.
- Tillsätt 1 ml 1,8% blekmedelslösning * innehållande 0,1% Tween-20. Blanda i 10 min. Spinn ner frön och aspirera blekmedel.
- Detta steg måste göras i ett laminärt flöde huva. Tillsätt 1 ml sterilt vatten till utsäde, blanda väl. Spinn ner frön, aspirera vatten. Upprepa detta steg 5 gånger.
- Sprid fröna på det färdigställda i steg 1 plattor (100 frön / platta).
- Håll seedade plåtar i 24-48 timmar vid 4 ° C i mörker skiktning.
- Odla växter i 14 dagar i tillväxten kammare med 8 h light/16 h mörker fotoperiod (vid en fotosyntetiska foton flödestäthet på 250 mikromol m -2 s -1) vid 23 / 19 ° C ljus / mörker temperatur regimen och 75% relativ luftfuktighet.
* Tips 1: Bleach lösning är sydda genom utspädning ett hushåll Clorox, som innehåller 6% natriumhypoklorit och lägga Tween-20 till en slutlig koncentration på 0,1%.
Del 3. Isolering av protoplasts från Arabidopsis plantor.
- Skiva 2 g 14-dagar gamla plantor med en färsk rakblad i 15 ml filtersteriliserad-TVL lösning. Vi hugger växtmaterial i sterila engångsprodukter petriskålar.
- Överför hackad vävnader i 200 ml bägare, tillsätt 20 ml av filter-steriliserade Enzyme lösning, snurra bägaren att låta vävnader blanda med Enzyme Solution, täck med parafilm och aluminiumfolie.
- Skaka plantvävnader på 35 varv i mörker vid rumstemperatur i 16-18 h.
- Samla släpps protoplasts till 50 ml Falcon rör genom passering genom 8 lager av osten tyg, pre-våt i W5 Solution.
- Sila protoplasts från ost-trasan en gång till genom att tvätta trasan med 15 ml W5 Solution.
- Noggrant overlay protoplasts med 10 ml W5 lösning, stör inte sockret lutning, centrifugera i 7 min på 100 g.
- Samla 10 ml protoplasts i gränssnittet enzym Solution och W5 Solution (Fig. 1B) och överför till en ny 50 ml Falcon rör.
- Tillsätt 15 ml W5 Solution, Centrifugera i 5 min vid 60 g. Avlägsna supernatanten.
- Tvätta protoplasts fri från Enzyme lösning genom resuspending protoplasts i 15ml av W5 lösning, centrifugera i 5 min vid 60 g
- Avlägsna supernatanten, återsuspendera pelleterat protoplasts i 1-3 ml W5 lösning.
- Utvärdera protoplastfusion skörden med cell räknar med en hemocytometer.
Del 4. Reagens:
TVL: 0,3 m sorbitol, 50 mM CaCl 2 Filter-sterilisera och förvara vid -20 ° C.
Enzym Lösning: 0,5 M sackaros, 10 mm MES-KOH [pH 5,7], 20 mm CaCl 2, 40 mm KCl, 1% cellulas (Onozuka R-10), 1% Macerozyme (R10). Filter-sterilisera och nyligen använda.
W5 Lösning: 0,1% (w / v) glukos, 0,08% (v / v) KCl, 0,9% (w / v) NaCl, 1,84% (w / v) CaCl 2, 2 mm MES-KOH pH 5,7. Filter-sterilisera och förvara i rumstemperatur.
Del 5: representativa resultat:
Använda Arabidopsis kultur förhållanden som beskrivs i del 1 och 2 gör friska plantor, lämplig för isolering protoplasts (bild 1A). Protoplastfusion renas genom att sackaros densitet gradiENT centrifugering och samlas i gränssnittet mellan W5 och lösningar Enzyme (Fig. 1B). Använda förfarande protoplastfusion isolering som beskrivs i del 3 skördar vi normalt 5-10 10 6 av intakt protoplasts (bild 1C) från ett gram färska plantor.
Figur 1. Isolering av protoplasts från Arabidopsis plantor. En var Vävnader från 14-dagar gamla plantor av Arabidopsis samlas in och omvandlas till protoplasts av en modifierad förfarande (Chen och Halkier, 2000). B, var Protoplasts renas genom sackaros densitetsgradient centrifugering och samlas i gränssnittet mellan enzym lösning och W5 uffer (vita pilar). C, Bright-området mikroskopi av protoplasts. Mikrofotografier samlades in med hjälp av en kyld CCD-kamera gränssnitt med Zeiss Axioscope 2 plus mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att garantera hög avkastning av intakt protoplastfusion det är mycket viktigt att starta med friska växter. Använd filter-sterilisera lösningar för att isolera protoplasts. Kom ihåg att protoplasts är sköra. Därför, när du hanterar protoplasts inte blanda, pipett eller virvel dem kraftigt eftersom det kommer att bromsa dem. Istället blanda protoplasts av långsamt roterande eller tejpning centrifugröret. Det beskrivna förfarandet ger intakt protoplasts som är livskraftiga i minst 96 h. Därför kan protoplasts användas för att studera en mängd olika cellulära processer, såsom subcellulära lokalisering av proteiner, isolering och analys av intakt organeller och riktade gen-inaktivering av dubbelsträngat RNA interferens (RNAi), etc 3-5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De provisoriska patentansökan som beskriver detta förfarande för dess användning i funktionella analyser av växt-gener har registrerats hos Cornell Centrum för Teknik Näringsliv och kommersialisering (CCTEC), juni 2008. Docket Nej 50341/015001: Vatamaniuk, OK och Zhai, Z. metod för snabb funktionella analyser av växt-gener.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Cornell University Agricultural Experiment Station (CUAES) NYC-125.433 Hatch Grant och Cornell startpeng tilldelas OKV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MurashigeandSkoogBasalSaltMixture(MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| PetriDishes(100x15mm) | Krackeler Scientific, Inc. | 82-4001 | |
| Cellulase(OnozukaR‐10) | Research Products International Corp. | C32200 | |
| Macerozyme(R10) | Research Products International Corp. | M22010 | |
| Cheeseclothwipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | |
| LabRotator | Fisher Scientific | 1167152Q | |
| AllegraX‐15RCentrifuge | VWR international | 392932 | |
| Axioskop2PlusMicroscope | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
