Dela upp och inspelning från The C. elegans neuromuskulära förbindelsen

Summary

Tillämpning av elektrofysiologi till tillgängliga synapser ger ett kvantifierbart mått av synaptisk aktivitet, användbara i analysen synaptisk mutanter. Den här artikeln beskriver en dissektion metod som används för att exponera den neuromuskulära korsningar (NMJ) av<em> Caenorhabditis elegans (C. elegans)</em> Och kortfattat diskuterar några av de användningsområden som denna beredning kan tillämpas.

Abstract

Neurotransmissionen är den process genom vilken nervceller överföra information via kemiska signaler till sina postsynaptiska mål, på en snabb tid skala. Denna komplexa process kräver ett samordnat verksamheten i många pre-och postsynaptiska proteiner för att säkerställa lämplig synaptiska anslutningsmöjligheter, överledning av elektriska signaler, med inriktning och grundning av sekretoriska vesikler, avkänning kalcium, vesikelfusion, lokalisering och funktion av postsynaptiska receptorer och slutligen återvinning mekanismer. Som neuroforskare Det är vårt mål att kartlägga vilka proteiner fungerar i varje steg och förstå deras verkningsmekanismer. Elektrofysiologiska inspelningar från synapser ge en kvantifierbar läsa upp de underliggande elektriska händelser som inträffar under synaptisk överföring. Genom att kombinera denna teknik med kraftfull uppsättning molekylära och genetiska verktyg för att manipulera synaptiska proteiner i C. elegans kan vi analysera den resulterande funktionella förändringar i synaptisk transmission.

C. elegans NMJs bildas mellan motoriska nervceller och kropp muskler vägg kontroll förflyttning därför mutanter med okoordinerade motoriskt fenotyper (sk UNC s) ofta störa synaptiska överföringen på dessa synapser ^1. Eftersom UNC mutanter upprätthålls på ett rikt utbud av en bakteriell föda, är de fortfarande livskraftig, så länge de behålla en del svalget pumpning förmåga att inta föda. Detta, tillsammans med det faktum att C. elegans existera som hermafroditer, tillåter dem att föra vidare muterade avkomma utan att behöva utarbeta parning beteenden. Dessa attribut, tillsammans med vår senaste möjlighet att spela in från maskar NMJs ^2,3,7 gör detta till en utmärkt modell organism där för att ta itu exakt hur UNC mutanter påverkan neurotransmission.

Den dissektion Metoden innebär immobilisera vuxna maskarna med hjälp av en cyanoacrylic lim för att göra ett snitt i masken nagelbanden exponera NMJs. Eftersom C. elegans vuxna bara 1 mm i längd dissektionen utförs med hjälp av en dissekera mikroskop och kräver god hand-öga-koordination. NMJ inspelningar görs av hel-cellspänning fastspänning individuella kroppens celler väggen muskler och frisättningen av neurotransmittorer kan framkallas med hjälp av olika stimuleringsprotokoll inklusive elektrisk stimulering, ljusaktiverat kanal rhodopsin-medierad depolarisation ⁴ och hyperosmotic koksaltlösning, som alla kommer att beskrivs kortfattat.

Protocol

A. Beredning av verktyg som används för dissekering. Den dissektion / inspelning kammare: Vi brukar konstruera inspelning kammare av en 1 / 16: e tum magnetisk plåt, med ett cirkulärt hål borras i centrum som är stor nog att rymma en 22 mm diameter rund skyddsglas. De yttre dimensionerna av kammaren kommer att bero på mikroskop scenen används för att göra inspelningar. På baksidan av den magnetiska blad, fäster vi ett 48 x 60 slip mm omfattar, som vi följer i kammaren genom att placera…

Discussion

Den genetiska modellorganism C elegans är idealiskt för studier av synaptisk transmission genom funktionell analys av mutationer i gener som kodar synaptiska proteiner. Här har vi beskrivit en dissektion teknik som gör C. elegans NMJs tillgänglig för elektrofysiologiska analys. Den medföljande videon visar de kritiska stegen i C. elegans dissektion och den typiska inspelning konfiguration används för att mäta synaptisk aktivitet. De tre stegen som utgör de största utmaningarna i at…