Summary
此过程演示的纯化和体外扩增抗原特异性CD4 +从整体外周血T细胞及其可视化使用MHC II类四聚体。四聚体，允许直接与单个抗原特异性T细胞和定义MHC II类限制性的可视化。
Abstract
主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类四聚体可以直接可视化的抗原特异性CD4 + T细胞流式细胞仪。此方法依赖于非常具体的肽载入MHC和相应的T细胞受体之间的互动。虽然单一的MHC /肽分子的亲和力低，交叉连接链霉亲和的MHC /肽复合物增加亲和力的互动，使染色试剂的使用。由于CD4 + T细胞（〜1 30万为一个单一的特异性）的频率相对较低，本试验利用体外扩增步骤，以提高其检测阈值。纯化外周血单个核细胞经Ficoll底图。然后由消极的选择，使用生物素抗体鸡尾酒和抗生物素标记的磁珠分离CD4 +细胞。使用贴壁细胞的CD4细胞的一小部分，作为抗原提呈细胞，CD4 + T细胞在媒体扩大，加入的抗原肽和IL - 2。孵化一小时，随后在37℃染色使用表面抗体，如抗CD4，抗CD3和抗CD25扩大细胞与相应的Ⅱ类四聚体染色。标签后，细胞可以直接通过流式细胞仪分析。扩大CD4 +细胞中的四聚体阳性细胞通常形成一个独特的人口。四聚体阳性细胞通常CD25 +调节性和经常的CD4高。由于背景的四聚体染色水平可以有所不同，应该始终是积极的染色结果相比，相同的细胞与一个不相关的四聚体染色。这一基本检测的多种变化是可能的。四聚体阳性细胞可能为进一步的表型分析，列入酶联免疫斑点或增殖实验，或其他二次检测进行排序。一些团体也展示了合作，使用四聚体的抗细胞因子或抗FOXP3抗体染色。
Protocol
1。外周血单个核细胞（PBMC）隔离
- 获取血液样本 - 血液应收集在注射器或血管和（1:50的比例）与肝素的抗凝固，防止凝血。预计产量约1 × 10 6外周血单个核细胞每毫升血液-其中约40％将CD4阳性（CD4 +）T细胞。
- 分装成50 ml锥形管，每管25毫升的血液。如果血液分离，轻轻混匀分发血浆前aliquoting
- 添加PBS中，使总体积至40毫升和11毫升的聚蔗糖底图，进入血液管插入，并仔细清除吸管吸管援助。聚蔗糖会慢慢流入试管底部。一旦有均衡的水平，慢慢取出吸管从血液管和丢弃。
- 第血液管和迁入Aerosolve罐。坚决关闭在900和离心罐× G 20分钟 - 没有刹车。至关重要的是，没有刹车是在本自旋月底施加制动力会扰乱细胞层。
- 分拆后，外周血应该形成一个独特的一层白色，黄色的等离子（上）和透明的聚蔗糖（下同）之间。轻轻脱脂白血细胞层，使用移液管转移到新管。可能制订了一些等离子和聚蔗糖与外周血单核细胞，但要避免制订任何红细胞层。气血两管通常可以在这一步相结合，以增加颗粒大小到一个单元格管。
- PBS中，使总体积至50 mL和离心机在500 × 15分钟，克 - aerosolve罐低制动。
- 使用巴斯德吸管吸液，注意不要扰乱沉淀
- 治疗溶血性缓冲，每个试管中加入5-6毫升，轻轻混匀删除团块。孵育不超过5分钟。
- 10分钟，加入PBS中，总量将在230至50 mL和离心机× G - 低制动。 Aerosolve罐不再需要这些较慢的旋转。
- 洗两次：使用巴斯德吸管吸液，填补管在230 × g 10分钟，用PBS和离心机。
- 到最后的洗涤步骤之前，请删除重新悬浮细胞等份，台盼蓝稀释，和计数使用血球。这种细胞计数，将决定在T细胞的分离步骤所用试剂卷。
2。 CD4 + T细胞分离*
- 吸液和添加运行缓冲液，使总量高达10亿个细胞的40％微升。这通常需要30 UL的缓冲加上剩余的沉淀量。
- 本卷转移到15 mL锥形管。
- 在冰上10分钟添加CD4提取试剂盒 - 抗体鸡尾酒10 UL每10万个单元格，帽筒，并将其放置
- 管取出冰，删除帽，并添加30 UL运行，每10万个单元格的缓冲区
- 添加CD4提取试剂盒磁珠 - 20 UL每10万个单元格，帽筒，并置于冰上15分钟
- 新增10卷运行缓冲液洗，在230 × g离心10分钟。
- 在旋转，设置在工作区中的磁铁和5 mL聚丙烯管
- 吸液体从细胞沉淀，加入2 ml运行缓冲和删除使用移液管的团块
- 使用相同的移液管，磁铁细胞转移，15分钟到5毫升的管和孵育
- 小心倒出的CD4 +细胞的一小部分成为一个显着的15毫升管反相磁铁和排空所有，但最后一滴血
- 运行缓冲液5毫升管的另一个2 mL的添加和删除从磁铁
- 轻轻冲洗掉管转移到一个显着的15 mL试管双方的CD4细胞
- 每管加入2 ml T细胞培养基，细胞计数和离心10分钟，分装在230 × g删除。
- 细胞分装和稀释台盼蓝计数使用一个血球。这些细胞计数将决定用于扩展文化一步井的数量。
*另外，MACS列珠（美天旎生物技术公司），AutoMACS细胞分离机（美天旎生物技术公司），或Robosep细胞分离机（干细胞技术），可根据使用到生产指令代替步骤2.2 - 2.11。
3。体外扩增培养
- 吸液的CD4 +和CD4细胞颗粒，根据细胞计数，文化传媒（通常为3万的CD4 +细胞每毫升10万每毫升的CD4细胞工程以及设立文化）。扩展文化需要3-5万CD4细胞，每孔2-3万CD4 +在总体积为1 mL培养基，在48孔培养板，每孔细胞。通常情况下，CD4 +细胞是限制人口
- 如果需要，照射的CD4细胞（5000拉德 S）。分装成井的适当数量的CD4细胞在48孔板中加入300-500微升到每个。板放置在37℃培养箱中培养1小时。贴壁CD4细胞作为抗原提呈细胞在扩张的文化。
- 从培养箱取出钢板。
- 加入500 uL的新媒体，轻轻吹打向上和向下转移吸管使用12-20倍，并删除所有的液体洗井。这洗会留下一层附着的抗原提呈细胞。
- 当清洗完成后，添加刚够媒体湿每口井的底部（约100 UL） - 否则，贴壁细胞，将干出来的
- 新增2-3万CD4 +细胞，每孔。如有必要，添加额外的媒体带来的总量在每口井最多至1 mL。
- 每口井所需的肽。为刺激经济增长的典型浓度是10微克/毫升的最后。
- 板放置在37℃培养箱中培养7天。
- 经过7天，加50 UL的Hemogen IL - 2（或同等学历，如重组IL - 2，10国际单位/毫升），每孔。
- 其后每一天，用显微镜监测细胞生长。饲料尚未卸下一半的媒体融合，加入新鲜的媒体和50 UL的IL - 2井。分裂resuspending的细胞，细胞的一半移动到一个空井，加入新鲜的媒体和50 UL的IL - 2融合井。返回到孵化器的细胞。
- 不断扩大的细胞，将准备为四聚体后13-15天文化。
4。可视化四聚体染色的T细胞
- 购买或组装四聚体相匹配的肽/ MHC的组合匹配的刺激CD4 + T细胞（见四聚体试剂的来源的讨论）。四聚体应〜0.5毫克/毫升的解决方案。
- 删除板从孵化器
- 小心吸取了媒体的一半，从每口井
- 等分从每孔细胞 - 转移到一个5毫升的聚苯乙烯流式细胞仪管 - 通常为75μL或约50,000个单元格
- 四聚体 - 通常每50μL总体积1μL - 并在37个地点° C培养箱中培养1-2小时。这也是最好的一个不匹配的四聚体作为阴性对照的细胞染色从每口井的第二等份。
- 标签细胞抗CD3，抗CD4，并通过添加3-10μL每个抗体的抗CD25抗体。可用于额外或替代的抗体标记。然而，不使用PE标记的抗体，因为这个通道必须保留的四聚体。此时，标签也单一颜色或同型控制使用多余的细胞。
- 孵育抗体标记的细胞为15-30分钟在冰上或4 ° C。
- 与运行在230 × g 10分钟的缓冲和离心机0.5至2毫升每管清洗。
- 小心倒出的液体从流式细胞仪管。商店在随后的流式细胞仪分析（最好是在冰）为有盖容器内所有的管子。
5。流式细胞仪的采集和分析
- 校准流式细胞仪使用参考珠。
- 验证仪器设置：
- 使用未染色的对照组细胞或同型对照，调整位置，可行的淋巴细胞门（FSC与SSC），。围绕每个轴的第一个十年以下的人口（通过改变增益设置），从所有渠道中删除的自体荧光。
- 使用单一的颜色控制管，每个单一颜色的正确象限内的中心事件（通过改变补偿设置）。
- 做微调的仪器设置，使用与一个毫不相干的四聚体染色的管。在特别设置的PE通道可能需要调整，往往因为四聚体染色的抗体比控制更亮。不相干的四聚体染色<0.5％的CD4 +细胞。
- 每管获取数据
- 收集每个样品管和阴性对照管的事件
- 采集和保存至少20,000观活动
- 分析数据
- 导入的数据文件到流式细胞仪分析软件（如CellQuest软件，WinMDI，或FlowJo）。使用管使用一个不相关的四聚体染色，开始您的分析。
- 剧情FSC与SSC和活的淋巴细胞（图1，左上面板）周围绘制一个门。
- 剧情CD4 +与CD3 +（门控显示生活淋巴细胞）和借鉴盖茨周围的CD3 +和CD4 +人群（图1右上角面板）。
- 情节的CD4与四聚体（门只显示CD3 +淋巴细胞）设置的象限边界的CD4 +四聚体+人口不到0.5％（图1底部左侧面板）。
- 剧情+ CD25与四聚体（门控显示CD4 +淋巴细胞），使CD25 +四聚体以上人口是小于0.5％（图1右下角面板）设置的象限边界。
- 分析没有改变的大门，所有样品管。
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图1代表负控制四聚体染色结果。左上方面板显示着分散的诗句侧散射和淋巴细胞的大小门（R1）。右上角的面板门R1的显示与抗CD3和CD3 +（R）和CD4 +（R3）的门蚂蚁CD4。左下面板R2的门，并显示与四聚体的抗CD4。右下面板R3的门，表明抗CD25与四聚体。为四聚体地块的四个象限，分别设置为0.5％。
6。代表性的成果
- 四聚体阳性细胞应扩大CD4 +细胞（图2）中的一个不同的人口。
- 四聚体阳性细胞通常CD25 +调节性和经常的CD4高。
- 在某些情况下，一个的MHC /肽结合，可以给背景染色（通常是由肽溶解性差造成）。从一个真正的积极的，因为“假阳性”细胞是不是一个单一的四聚体或CD25与四聚体图（图3）与CD4不同的人口，这样的背景下染色可以区别。
图2代表积极的四聚体染色结果。面板的布局和闸门战略是一致的图1。作为一个独特的高人口与四聚体的抗CD25与四聚体面板的面板和鲜明的CD25 +人口的抗CD4 CD4四聚体阳性细胞出现。
图3代表“假阳性”四聚体染色结果。面板的布局和闸门战略是一致的图1。与四聚体面板的抗CD4显示一个模糊的“mounded”染色。抗CD25与四聚体也显示了一个“mounded”染色，没有明显的趋势，对CD25 +调节性。
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Discussion
了解免疫的CD4 + T细胞的作用是极其重要的。然而，抗原特异性CD4 + T细胞可以用传统方法难以发现和隔离。相比之下，MHC II类四聚体，使所需的抗原特异性CD4 + T细胞的直接可视化。这个视频演示的分离，纯化，并在体外扩增的CD4 + T细胞，并随后将其可视化，使用四聚体。 II类四聚四是荧光蛋白偶联物的水溶性生物素化的II类的α/围绕一个荧光标记的链霉亲和的核心（图4）结合β二聚体组成。在本视频中使用的四聚体在Benaroya研究所Teramer核心实验室使用昆虫细胞培养（1）生产。这些四聚体准备为0.5 mg / mL的溶液可以在4 ° C储存6-18个月。四聚体应该永远不会被冻结，冻融压力的PE标签，从steptavidin核心地带。第二类染色试剂，可从几个来源（表1）和指定的四聚体，“ultimers”，和多。应该指出的是，这里所描述的四聚体检测程序，从为我类四聚体所用的程序是不同的。 I类四聚体染色通常是最优的，在4 ° C，而II类四聚体染色，一般要求37 ° C。 I类四聚体的结合更加紧密地比II类四聚体，因为较强的协同效应的CD8 T细胞相比，对CD4。这里描述的四聚体检测是在可视具体无论是外国或自身抗原的T细胞是有效的，但本质上是对自身抗原相互作用的强度较低。检测的几个变化是可能的。例如，CD4 + T细胞可以进一步分割前刺激（如入内存和天真的人口），刺激用一个整体的蛋白质或肽池（2），或各种治疗可能会被添加到不同的井来衡量的抗原自己的影响力具体的回应。由于只有每口井的部分是四聚体分析需要，剩下的细胞能够进行排序或预留作其他用途的四聚体染色。为每个实验的设置将取决于样品的特点和被要求的科学问题。设计的目的，它是至关重要的了解献血者的HLA型，因为这会影响用于扩张的抗原表位，将决定必须使用相应的四聚体。疾病或免疫状态的知识，也可以解释结果的关键。重要的是认真保持在扩增步骤中的细胞，因为不健康的细胞，可以给很差的结果。此外，正确的机器安装，浇注和阴性对照，获得高品质的流式细胞仪检测结果都是极其重要的。
图4 MHC II类四聚体的示意图。红色的核心代表的链霉亲和聚乙烯的分子。绿色和黑色的扩展代表的MHC II类α/β二聚体。复杂的是加入了由生物素链亲和素之间的高亲和力的互动。
表1：各种来源的II类染色试剂
| 四聚体来源 | 产品类型 | 网址 |
| Beckman Coulter公司 | 四聚体 | www.beckman.com |
| 美国国立卫生研究院四聚体设施 | 四聚体 | www.research.yerkes.emory.edu / tetramer_core |
| Proimmune | Ultimers | www.proimmune.com |
| Benaroya研究学院 | 多聚体 | www.benaroyaresearch.org |
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Acknowledgments
我们感谢他们在拍摄和视频制作的关键作用迪克弗利和Leigh金博尔。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1200 | Or equivalent |
| 50 mL conical Tube | equipment | VWR international | 47747-182 | Or equivalent |
| 1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | Hyclone | SH30028.02 | Or equivalent |
| Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
| Pipet Aid XP | equipment | Drummond Scientific | 4-000-101 | Or equivalent |
| 10 mL pipet | equipment | Corning | CLS4492 | Or equivalent |
| Aerosolve Canisters | equipment | Beckman Coulter Inc. | 359481 | with 50 mL inserts |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | GS-6R | Or equivalent |
| Transfer pipets | equipment | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 202-20S | Or equivalent |
| Pasteur pipets | equipment | VWR international | 14672-200 | Or equivalent |
| Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
| Trypan blue | Reagent | Sigma-Aldrich | T6146 | 0.2% in PBS |
| Hemocytometer | equipment | VWR international | 15170-208 | |
| 15 mL conical tube | equipment | VWR international | 05-527-90 | Or equivalent |
| Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
| MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
| EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| 5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon BD | 352063 | |
| RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
| Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
| Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
| 500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalge Nunc international | 595-3320 | Or equivalent |
| 48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
| 37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo | MCO-18AIC | Or equivalent |
| 20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
| 5 mL FACS tube | equipment | Falcon BD | 352008 | Polystyrene |
| Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
| Anti-CD3 | Reagent | BD Biosciences | 347344 | Or equivalent |
| Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
| Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
| Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |
References
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens. J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).
