Summary
호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 2.
Abstract
가족
Protocol
1 부 : RNA로부터 cDNA 합성
- 앰비온 아미노 알릴 MessageAmp II 키트를 사용하기 전에, 세척 버퍼에 100 % 에탄올의 권장 볼륨을 추가합니다.
- PCR 반응 관에서 T7 oligo (DT) 프라이머 총 RNA 및 1μl의 5μg을 100ng 사이를 추가합니다. nuclease 무료 물로 12μl에 볼륨을 가져와.
- 70 샘플을 품어 ° C thermocycler 10 분.
- ° C와 원심 분리기 간략 70 RNA 샘플을 제거합니다. 얼음 놓습니다.
- 1 일 스트랜드 합성 마스터 믹스를 준비하고 (오류 pipetting 10 % 없더군요)를 실온에서 보관. (표 1)
- 부드럽게 피펫 마스터 믹스이나 제스처는 혼합 후 간단히 원심 분리기.
- 각 RNA 샘플을 마스터 믹스 8μl을 전송합니다. 3-4 회를 아래와 pipetting하여 섞는다.
- thermocycler 2 시간 동안 42 ° C에서 알을 품다.
- 얼음 원심 분리기 샘플의 잠시 장소. 즉시 dsDNA 합성의 다음 단계로 진행합니다.
- 얼음 2 차 스트랜드 합성 마스터 믹스 (오류를 pipetting 10 % 없더군요 포함). (표 2)를 준비
- 부드럽게 피펫 마스터 믹스이나 제스처는 혼합 후 간단히 원심 분리기.
- 각 샘플에 80μl를 전송하고 부드럽게 3-4 회를 아래와 pipetting하여 섞는다.
- thermocycler 2 시간 동안 16 ° C에서 알을 품다.
- 2 시간 부화 후 cDNA 정리 단계로 진행 또는 -20 ° C. 즉시 동결
2 부 : 두 번 좌초 cDNA 청소
- 냉장고에서 cDNA 순수를 제거하고 사용하기 전에 30 분 방 온도로 평형 수 있습니다. 완전히 사용하기 전에 자기 cDNA 바인딩 구슬을 resuspend 수있는 병을 흔들어.
- 1.5mL 튜브와 50-60에서 품어 ° C 이전의 2 시간 배양 기간 동안 적어도 10 분 동안에 나누어지는 nuclease없는 물.
- 각 샘플에 cDNA 순수의 180μl를 추가하고, 철저하게 최대 pipetting 아래로 섞는다. 96 - 잘 왕복 하단 플레이트에 샘플을 전송합니다.
- 부드럽게 최소한 2 분 동안 궤도 쉐이크에 대한 번호판을 흔들어하여 샘플을 섞어 계속합니다.
- 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. 약 6 분 동안 증언대에 접시를 남겨 또는 혼합물이 투명하게되고 바인딩 비즈가 pelleted 때까지.
- 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
- 각 잘하는 150μl cDNA 씻으 버퍼를 추가하고 중간 속도로 궤도 쉐이크에서 1 분 접시를 흔들. 구슬은 세척 버퍼의 낮은 표면 장력으로 인해,이 단계에서 분산 않을 것입니다.
- 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다.
- 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
- 세차에게 150μl cDNA 씻으 버퍼와 함께 2 차 시간을 반복합니다.
- 2 차 세척 후, 최대 속도로 궤도 쉐이크 2 분 동안 접시를 흔들어하여 비즈를 건조. overdry하지 마!
- 각 샘플에 preheated nuclease없는 물 18μl를 추가하여 비즈에서 cDNA를 Elute.
- 적극적으로 궤도 쉐이크 3 분 동안 접시를 흔들 다음 자성 비즈가 완전히 분산되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않다면, 계속 떨고.
- 자기 비즈가 완전히 분산이되면, 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다.
- 조심스럽게 (~ 16μl) eluted cDNA는 새로운 PCR 플레이트 (또는 PCR 튜브)로 전송할 수 있습니다.
- 다음 단계로 바로 진행, 또는 -20 ° C.에서 cDNA를 동결
제 3 부 : 시험 관내 전사의 (IVT)
- 상온에서 IVT 마스터 섞는다. (표 3) 준비
- 부드럽게 마스터 믹스 또는 혼합에 영화를 피펫, 그리고 짧게 원심 분리기.
- 각 샘플에 24μl에 추가하고, 부드럽게 3-4 회를 아래와 pipetting하여 섞는다.
- thermocycler 14 시간 동안 37 ° C에서 품어, 다음 단계에 대한 ° C까지 준비 4 만요.
4 부 : 아르나 청소 IVT 후
- 소용돌이 RNA 바인딩 비즈 간단히 사용하기 전에도 혼합물을 얻을 수 있습니다.
- 상온에서 아르나 바인딩 믹스를 준비 (표 4) 이것은 미리 할 수 있습니다 -. 준비 바인딩 조합은 최대 일주일 위해 상온에서 저장할 수 있습니다.
- vortexing하여 잘 섞는다.
- 적어도 10 분 동안 50-60 ° C에서 1.5mL 튜브와 부화로 나누어지는 아르나의 용출 버퍼.
- 아르나 바인딩 믹스 70μl를 추가각 샘플과 3-4 회 위아래로 pipetting과로 잘 섞는다.
- PCR 플레이트에서 96 잘 왕복 하단 플레이트에 샘플을 전송합니다.
- 각 샘플에 이소프로판올 100 % 50μl를 추가하고 3-4 회 위아래로 pipetting과로 잘 섞는다.
- 부드럽게 철저하게 샘플을 혼합하기 위해 최소한 2 분 동안 궤도 쉐이크에 접시를 흔들.
- 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. 혼합물이 투명하게되고 바인딩 비즈가 pelleted 때까지 법정에 접시를 남겨주세요.
- 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
- 각 잘하는 100μl 아르나 와시 솔루션을 추가하고 중간 속도로 궤도 쉐이크에서 1 분 접시를 흔들. 구슬 완전히이 단계에서 분산되지 않을 수 있습니다.
- 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다.
- 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
- 세차에게 100μl 아르나 와시 솔루션 2 차 시간을 반복합니다.
- 2 차 세척 후, 최대 속도로 궤도 쉐이크 1 분에 대한 번호판을 흔들어하여 비즈를 건조. 샘플을 overdry하지 마!
- 각 샘플에 40μl preheated 아르나의 용출 버퍼를 추가하여 비즈에서 아르나을 Elute.
- 강력 3 분 궤도 쉐이크에 번호판을 흔들 다음 마그네틱 비즈가 완전히 분산되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않다면, 계속 떨고.
- 자기 비즈가 완전히 분산이되면, 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. 뜨는은 청소 접속 아미노 알릴 통합의 아르나가 포함되어 있습니다.
- 조심스럽게 새로운 PCR 플레이트 (또는 PCR 튜브)로 eluted 아르나를 전송합니다.
- (선택 단계) NanoDrop 분광 광도계에 1.5μl를 측정하여 시료의 RNA 농도를 확인합니다.
- 바로 다음 단계에 계속하거나, -80에서 아르나를 저장 ° C.
표 1 : cDNA 1 일 스트랜드 합성 마스터 믹스
| 시약 | 한 반응에 대한 금액 |
| 10X 먼저 스트랜드 버퍼 | 2 μl |
| dNTP 믹스 | 4 μl |
| Ribonuclease 억제제 | 1 μl |
| 배열 스크립트 | 1 μl |
표 2 : cDNA 2 차 스트랜드 합성 마스터 믹스
| 시약 | 한 반응에 대한 금액 |
| Nuclease 무료로 물 | 63 μl |
| 10X 둘째 스트랜드 버퍼 | 10 μl |
| dNTP 믹스 | 4 μl |
| DNA 효소 | 2 μl |
| RNase H | 1 μl |
표 3 : IVT 마스터 믹스
| 시약 | 한 반응에 대한 금액 |
| aaUTP 솔루션 (75 ㎜) | 2 μl |
| ATP, CTP, GTP 믹스 (25 ㎜) | 12 μl |
| T7 UTP 솔루션 (75 ㎜) | 2 μl |
| T7 10X 반응 완충액 | 4 μl |
| T7 효소 믹스 | 4 μl |
표 4 : 아르나 바인딩 믹스
| 시약 | 한 반응에 대한 금액 |
| RNA 바인딩 비즈 * | 10 μl |
| 비드 Resuspension 솔루션 * | 4 μl |
| 백퍼센트 이소프로판올 ** | 6 μl |
| 아르나 바인딩 버퍼 컨센트레이트 | 50 μl |
* 먼저 비드 resuspension 솔루션 RNA 바인딩 비즈를 섞습니다.
** 이소프로판올를 추가하고 아르나 바인딩 버퍼 집중을 추가하기 전에 잘 섞는다.
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Discussion
중요 단계
배열 데이터에 편견이 관찰되었습니다로서 증폭의 두 번째 라운드는 권장되지 않습니다. 각 효소 단계 (1 일 및 2 차 가닥 cDNA 합성, IVT)에서 신중하게 혼합하는 것은 각 단계의 효소 배양은 적절한 온도는 좋은 증폭 수율을 얻는 것이 중요합니다. 도 편차를 공기 하이브 리다이 제이션 오븐이나 물 목욕 하이브 리다이 제이션에서 IVT 중 2-3 도까지처럼 작고 크게 증폭 제품의 수율에 영향을 줄 수 있습니다 - 온수 조절 뚜껑이있는 PCR의 자전거 타는 사람이 좋습니다.
신청 / 의의
이 프로토콜에서 발생하는 분류 RNA는 문화에 감염된 세포에 유전자 표현 반응을 평가하기 위해 인간, 바이러스, 또는 사용자 정의 microarrays에 hybridized 수 있습니다. Microarray 플랫폼 다양하므로 표시된 프로브에서 하이브 리다이 제이션 혼합물의 준비에 대한 제조 업체의 지침을 따르시기 바랍니다.
사용자 정의 설계 poxvirus 배열 하나를 사용하여, 우리는 바이러스성 DNA 복제는 성적표 감지에 필요한되었습니다 여부 "조기"또는 "늦은"하이브리드화 신호의 타이밍에 기반의 일반적인 범주로 유전자를 분류할 수 있었다. 우리는 전사의 정확한 타이밍에 각 시간적 클래스의 유전자의 예상 기능 범주 (즉, 초기 중급과 늦은 유전자를 예상) 변화를 관찰했다.
이 작품의 활용 방법은 지속하고 있습니다 초기 또는 복제주기의 후반 베꼈는데 바이러스 유전자를 예측할 수 있지만, 이중 늦은 / 이른 발기인과 성적 때문에 초기 늦게 모터와 유전자 비교 더 많은 어려움을 조기 전용 구별을 늦은 시간에 발견했습니다. 배열에 hybridizing RNA가 지정된 ORF 또는 업스트림 ORF에서 온 수 있기 때문에 이외에도, 후반 바이러스 유전자의 전사 -을 통해 실행, 배열에 지정된 프로브 / 지점에서 신호에 영향을 미칠 수 있습니다. 기와 배열이 문제를 해결하기 위해 시도해야하지만 도전 하이브 리다이 제이션을 기반으로 접근 2,3,4를 사용하여 녹음을 통해 실행 탐지에 남아 있습니다.
호스트 transcriptional 패턴은 이러한 방법을 사용하여 평가하실 수 있습니다. 그러나, 우두는 호스트 반응을 억제하는 메커니즘을 다양한 인코딩하고, 호스트 transcriptional 응답은 다른 자극 5,6,7,8에 비해 줄어들 수 있습니다. 호스트 방어에 관련된 많은 유전자의 표현은 감염 후 변경이기 때문에, 호스트 면역 반응을 중화 바이러스 유전자의 기여 따라서 고려하여야한다.
이러한 방법을 활용하여 모든 바이러스 유전자의 transcriptional 타이밍의지도를 식별하고 알려지지 않은 바이러스 유전자의 기능을 심문하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,이 방법은 바이러스와 호스트 간의 복잡한 대화를 해부하다을 이용하실 수 있습니다. 이러한 방법은 다른 호스트 병원체 감염 시스템에 광범위하게 적용됩니다. 관심의 병원체가 mRNAs을 polyadenylated이없는 경우, 다른 방법은 선형 증폭하지 않고, 직접 총 RNA 레이블을 사용할 수 있습니다. 동기 감염 동안 두 호스트 및 바이러스 유전자 발현을 분석함으로써, 이러한 방법은 우리가 바이러스 감염에 대한 숙주 세포 환경뿐만 아니라 호스트 카운터 - 방어와 바이러스의 상호 작용에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
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Acknowledgments
화이트 헤드 연구소 펠로 자금
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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