Summary
Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 2 de 3.
Abstract
A família
Protocol
Parte 1: síntese de cDNA a partir de RNA
- Antes de usar o Ambion Amino Allyl MessageAmp II kit, adicionar o volume recomendado de etanol a 100% para os buffers de lavagem.
- PCR em tubo de reação, adicione entre 100ng de 5μg de RNA total e 1μl de T7 oligo primer (dT). Trazer o volume até 12μl com água livre de nuclease.
- Incubar as amostras a 70 ° C por 10 min em um termociclador.
- Remover amostras de RNA a partir de 70 ° C e centrifugar brevemente. Colocar no gelo.
- Preparar o 1 º Strand master mix Síntese e manter a temperatura ambiente (com excesso de 10% para pipetagem de erro). (Tabela 1)
- Pipeta suavemente Mix Master ou filme para misturar e então centrifugar brevemente.
- Transferência 8μl do Mix Master para cada amostra de RNA. Mix pipetando cima e para baixo 3-4 vezes.
- Incubar a 42 ° C por 2 horas no termociclador.
- Brevemente centrifugar amostras e colocar no gelo. Prosseguir imediatamente para a próxima etapa de síntese de dsDNA.
- Prepare o 2 º Strand master mix de síntese sobre gelo (com sobrecarga de 10% para pipetagem de erro). (Tabela 2)
- Pipeta suavemente Mix Master ou filme para misturar e então centrifugar brevemente.
- Transferência Pipete 80 para cada amostra e misture suavemente pipetando cima e para baixo 3-4 vezes.
- Incubar a 16 ° C por 2 horas no termociclador.
- Após a incubação de 2 horas, prosseguir com a etapa de clean-up cDNA ou congelar imediatamente a -20 ° C.
Parte 2: Double-stranded cDNA clean-up
- Remover o Pure cDNA do frigorífico e deixe-o atingir a temperatura ambiente por 30 minutos antes de usar. Agitar o frasco plenamente ressuspender o cDNA magnética contas obrigatórias antes do uso.
- Alíquota de água livre de nuclease em um tubo de 1,5 ml e incubar a 50-60 ° C durante pelo menos 10 minutos durante a incubação prévia 2hr.
- Adicionar 180μl de Pure cDNA de cada amostra, e misturar completamente por pipetagem cima e para baixo. Transferir as amostras para uma placa de 96 poços de fundo redondo.
- Continue a misturar as amostras agitando a placa em agitador orbital por pelo menos 2 minutos.
- Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. Deixe placa no stand por aproximadamente 6 minutos, ou até que a mistura torna-se transparente e os cordões de ligação a peletizada.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante.
- Retire a placa do suporte magnético.
- Adicionar 150μl tampão de lavagem cDNA a cada poço e agitar a placa por 1 minuto no agitador orbital a uma velocidade moderada. Contas não se dispersa nesta etapa, devido à baixa tensão superficial da solução de lavagem.
- Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante.
- Retire a placa do suporte magnético.
- Repita a lavagem de cada vez 2 º com tampão de lavagem 150μl cDNA.
- Após a lavagem 2 º, seca as contas agitando a placa por 2 minutos no agitador orbital à velocidade máxima. Não overdry!
- Eluir o cDNA dos grânulos adicionando 18μl da água livre de nuclease pré-aquecido a cada amostra.
- Agitar vigorosamente a placa por 3 minutos no agitador orbital, em seguida, verifique se a esferas magnéticas estão totalmente dispersos. Se não, continue a tremer.
- Uma vez que a esferas magnéticas têm totalmente disperso, mova a placa a um suporte magnético para capturar as esferas magnéticas.
- Transferir cuidadosamente o cDNA eluída (~ 16μl) para uma placa de PCR nova (ou tubos de PCR).
- Prosseguir diretamente para a etapa seguinte, ou congelar o cDNA a -20 ° C.
Parte 3: transcrição in vitro (IVT)
- Prepare a mistura mestre IVT à temperatura ambiente. (Tabela 3)
- Pipeta suavemente o Mix Master ou filme para misturar e centrifugar brevemente.
- Adicionar 24μl de cada amostra, e misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes.
- Incubar a 37 ° C por 14 horas em um termociclador, então segure a 4 ° C até que esteja pronto para a próxima etapa.
Parte 4: ARNA clean-up após IVT
- Vortex as contas RNA ligação rapidamente para obter uma mistura mesmo antes do uso.
- Preparar a mistura ARNA Binding à temperatura ambiente (Tabela 4) Isso pode ser feito antes do tempo -. A mistura preparada ligação pode ser armazenado em temperatura ambiente por até uma semana.
- Misture bem em vórtice.
- Alíquota do tampão de eluição ARNA em um tubo de 1,5 ml e incubar a 50-60 ° C durante pelo menos 10 minutos.
- Adicionar 70μl da mistura obrigatória ARNApara cada amostra e misture bem por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes.
- Transferência das amostras da placa de PCR para uma placa de 96 poços de fundo redondo.
- Adicionar 50μl de isopropanol 100% a cada amostra e misture bem por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes.
- Agitar suavemente a placa em agitador orbital por pelo menos 2 minutos para misturar as amostras.
- Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. Deixar a placa no stand até que a mistura torna-se transparente e os cordões de ligação a peletizada.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante.
- Retire a placa do suporte magnético.
- Adicionar 100μl de solução de lavagem ARNA a cada poço e agitar a placa por 1 minuto no agitador orbital a uma velocidade moderada. Contas não pode se dispersar totalmente nesta etapa.
- Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante.
- Retire a placa do suporte magnético.
- Repita a lavagem de cada vez 2 º com 100μl de solução de lavagem ARNA.
- Após a lavagem 2 º, seca as contas agitando a placa por 1 minuto no agitador orbital à velocidade máxima. Não overdry as amostras!
- Eluir a ARNA dos grânulos adicionando 40μl tampão de eluição ARNA pré-aquecido para cada amostra.
- Agitar vigorosamente a placa no agitador orbital por 3 minutos, em seguida, verifique se a esferas magnéticas estão totalmente dispersos. Se não, continue a tremer.
- Uma vez que a esferas magnéticas têm totalmente disperso, mova a placa a um suporte magnético para capturar as esferas magnéticas. O sobrenadante contém a limpo-up amino-alil ARNA incorporadas.
- Transferir cuidadosamente o ARNA eluída a uma placa de PCR nova (ou tubos de PCR).
- (Passo opcional) Verificar a concentração de RNA das amostras medindo 1.5μl em um espectrofotômetro NanoDrop.
- Imediatamente continue para a próxima etapa, ou armazenar a ARNA a -80 ° C.
Tabela 1: 1 Strand cDNA º Mix Master Síntese
| Reagente | Montante para uma reação |
| Tampão Strand 10X Primeiro | 2 l |
| dNTP Mix | 4 mL |
| Inibidor ribonuclease | 1 ml |
| Script da Matriz | 1 ml |
Tabela 2: 2 ª Strand cDNA Mix Master Síntese
| Reagente | Montante para uma reação |
| Água livre de nuclease | 63 mL |
| Tampão 10X Segundo Strand | 10 ml |
| dNTP Mix | 4 mL |
| DNA Polimerase | 2 l |
| RNase H | 1 ml |
Tabela 3: IVT Master Mix
| Reagente | Montante para uma reação |
| aaUTP solução (75 mM) | 2 l |
| ATP, CTP, GTP mix (25 mM) | 12 mL |
| T7 UTP solução (75 mM) | 2 l |
| T7 Tampão de reacção 10X | 4 mL |
| T7 Mix Enzyme | 4 mL |
Tabela 4: ARNA Mix Binding
| Reagente | Montante para uma reação |
| Beads RNA Binding * | 10 ml |
| Bead * Solução ressuspensão | 4 mL |
| Isopropanol 100% ** | 6 mL |
| ARNA Concentrado de tampão de ligação | 50 ul |
* Mix as contas RNA ligação com a solução de ressuspensão primeira conta.
** Adicione o isopropanol e misturar bem antes de adicionar o ARNA concentrado de tampão de ligação.
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Discussion
Passos crítica
A segunda etapa de amplificação não é aconselhável como preconceitos em dados de matriz foram observados. Misturando com cuidado a cada passo enzimático (1 ª e 2 ª vertente de síntese de cDNA, FPI) é fundamental para a obtenção de rendimentos de amplificação boa, como é de incubação de cada etapa enzimática na temperatura adequada. A cycler PCR com tampa aquecida ajustável é o preferido - desvios ainda tão pequeno quanto 2-3 graus durante IVT em um forno de hibridização de ar ou de hibridização banho de água podem afetar significativamente a produção de produto amplificado.
Application / Significado
O RNA marcado resultantes deste protocolo pode ser hibridizado com humanos, microarrays viral, ou o costume de avaliar as respostas de expressão gênica de células infectadas em cultura. Plataformas microarray variam, por isso siga as instruções do fabricante para a preparação de mistura de hibridização da sonda marcada.
Usando uma matriz poxvírus personalizados 1, fomos capazes de classificar os genes nas categorias geral de "precoce" ou "atrasado" com base no tempo do sinal de hibridização e se ou não a replicação do DNA viral foi necessária para a detecção de transcrição. Observamos as categorias funcionais de genes esperados em cada classe temporal (ou seja, espera genes precoce, intermediária e tardia) a variação quanto ao momento exato de transcrição.
Os métodos utilizados neste trabalho são capazes de prever genes transcritos vírus cedo ou mais tarde no ciclo de replicação, mas têm mais dificuldade em distinguir início somente contra genes com um promotor precoce e tardia desde transcrições com um promotor cedo / tarde dupla pode persistir e ser detectada, por vezes, tarde. Além disso, run-through transcrição de genes virais tarde podem afetar sinal em um determinado teste / ponto na matriz, como a hibridação RNA para a matriz pode ter vindo da ORF designado ou uma ORF upstream. Arrays azulejos têm tentado resolver este problema, no entanto os desafios permanecem na detecção de executar através de transcrição usando abordagens baseadas hibridização 2,3,4.
Padrões anfitrião transcricional também pode ser avaliada através destes métodos. No entanto, vaccinia codifica uma variedade de mecanismos para inibir as respostas de acolhimento, e resposta do hospedeiro transcricional pode ser diminuída em comparação a outros estímulos 5,6,7,8. Uma vez que a expressão de muitos genes envolvidos na defesa do hospedeiro é alterada após a infecção, a contribuição de genes virais que neutralizam as respostas imune do hospedeiro deve ser levado em consideração.
Utilizando estes métodos, um mapa do tempo de transcrição de todos os genes virais podem ser identificadas e usadas para interrogar funções de genes desconhecidos viral. Além disso, estes métodos podem ser utilizados para dissecar o diálogo intrincado entre o vírus e hospedeiro. Estes métodos são amplamente aplicáveis a outros sistemas de acolhimento patógeno-infecção. Se o patógeno de interesse não tem polyadenylated mRNAs, métodos alternativos podem ser usados diretamente para rotular o RNA total, sem amplificação linear. Ao analisar o anfitrião e expressão de genes de vírus durante a infecção síncrona, estes métodos permitem-nos para obter insights sobre a interação do vírus com o ambiente celular do hospedeiro, assim como anfitrião contra-defesas contra infecção por vírus.
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Acknowledgments
Whitehead Institute Fellows Fundos
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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