Summary
פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 2 מתוך 3.
Abstract
המשפחה
Protocol
חלק 1: סינתזה cDNA מ-RNA
- לפני השימוש Ambion אמינו Allyl MessageAmp השנייה ערכה, מומלץ להוסיף נפח של אתנול 100% על מאגרים לשטוף.
- בתוך צינור התגובה PCR, להוסיף בין 100ng כדי 5μg של רנ"א 1μl הכולל של פריימר T7 (DT) אוליגו. תביאו את נפח עד 12μl עם מים nuclease חינם.
- דגירה דגימות ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב thermocycler.
- הסר דגימות רנ"א של 70 ° C ו צנטריפוגות בקצרה. מניחים על קרח.
- הכן את 1 סינתזה רחוב סטרנד לערבב אב לשמור בטמפרטורת החדר (עם overage 10% pipetting שגיאה). (לוח 1)
- מערבבים בעדינות פיפטה מאסטר או קפיצי לערבב ולאחר מכן צנטריפוגות בקצרה.
- העברת 8μl של מיקס מאסטר לטעום כל RNA. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
- לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות thermocycler.
- דגימות צנטריפוגה בקצרה ומניחים על קרח. להמשיך מיד לשלב הבא של סינתזה dsDNA.
- הכן את 2 nd סטרנד סינתזה מאסטר לערבב על קרח (עם overage 10% pipetting שגיאה). (לוח 2)
- מערבבים בעדינות פיפטה מאסטר או קפיצי לערבב ולאחר מכן צנטריפוגות בקצרה.
- העברת 80μl לטעום כל לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
- לדגור על 16 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות thermocycler.
- לאחר דגירה 2 שעה, להמשיך לשלב לנקות cDNA או להקפיא מיד -20 ° C.
חלק 2: פעמיים תקועים cDNA לנקות
- הסר את Pure cDNA מהמקרר ולאפשר לו לאזן את טמפ 'החדר למשך 30 דקות לפני השימוש. לנער את הבקבוק מלא resuspend חרוזים מגנטיים מחייב cDNA לפני השימוש.
- Nuclease ללא Aliquot מים לתוך צינור 1.5mL ו לדגור על 50-60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות במהלך הדגירה 2hr הקודם.
- הוסף 180μl של Pure cDNA לטעום כל אחת, לערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. העברת דגימות לצלחת מסביב לתחתית 96-היטב.
- ממשיכים לערבב בעדינות על ידי דגימות רועדות את הצלחת על שייקר מסלולית לפחות 2 דקות.
- הזז את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. השאירו צלחת על דוכן העדים במשך כ 6 דקות, או עד שהתערובת הופכת שקופה חרוזי מחייב יש pelleted.
- בזהירות לשאוב supernatant עם aspirator ואקום מבלי להפריע חרוזים מגנטיים. לחלופין, בזהירות להסיר את supernatant עם טפטפת וזורקים supernatant.
- הסר את צלחת מדוכן מגנטי.
- הוסף לשטוף 150μl הצפת cDNA זה היטב ולנער את הצלחת דקה 1 על שייקר מסלולית במהירות בינונית. חרוזים לא לפזר בשלב זה, בשל מתח הפנים הנמוך למאגר לשטוף.
- הזז את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים.
- בזהירות לשאוב supernatant עם aspirator ואקום מבלי להפריע חרוזים מגנטיים. לחלופין, בזהירות להסיר את supernatant עם טפטפת וזורקים supernatant.
- הסר את צלחת מדוכן מגנטי.
- חזור על לשטוף זמן 2 nd עם הצפת 150μl לשטוף cDNA.
- לאחר לשטוף 2 nd, לייבש את החרוזים על ידי רועדת את הצלחת למשך 2 דקות על שייקר מסלולית במהירות המקסימלית. אל overdry!
- Elute cDNA מן החרוזים ידי הוספת 18μl המים nuclease ללא שחומם מראש ל מדגם זה.
- בתוקף ללחוץ את הצלחת במשך 3 דקות על שייקר מסלולית, ואז לבדוק כדי לוודא חרוזים מגנטיים מפוזרים באופן מלא. אם לא, ממשיכים לרעוד.
- לאחר חרוזים מגנטיים התפזרו לגמרי, להעביר את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים.
- בזהירות העברת cDNA eluted (~ 16μl) לצלחת PCR חדש (או צינורות PCR).
- להמשיך ישירות לשלב הבא, או להקפיא את cDNA ב -20 ° C.
חלק 3: ב תמלול חוץ גופית (IVT)
- מכינים את תערובת מאסטר IVT בטמפרטורת החדר. (לוח 3)
- מערבבים בעדינות פיפטה מאסטר או קפיצי לערבב, ו צנטריפוגות בקצרה.
- הוסף 24μl לטעום כל אחד, לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות thermocycler, ואז להחזיק ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשלב הבא.
חלק 4: ארנה לנקות אחרי IVT
- וורטקס החרוזים RNA מחייב בקצרה להשיג תערובת אפילו לפני השימוש.
- מכינים את תערובת ארנה איגוד בטמפרטורת החדר (לוח 4) ניתן לעשות זאת מבעוד מועד -. תמהיל מחייב מוכנים ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד שבוע.
- מערבבים היטב על ידי vortexing.
- Aliquot elution ארנה הצפת לתוך צינור דגירה 1.5mL ועל 50-60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות.
- הוסף 70μl של תמהיל ארנה מחייבלטעום כל ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
- העברת דגימות הצלחת PCR לצלחת מסביב לתחתית 96-היטב.
- הוסף 50μl של 100% isopropanol לטעום כל ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
- נער בעדינות את הצלחת על שייקר מסלולית לפחות 2 דקות לערבב ביסודיות את הדגימות.
- הזז את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. השאירו את הצלחת על דוכן העדים עד שהתערובת הופכת שקופה חרוזי מחייב יש pelleted.
- בזהירות לשאוב supernatant עם aspirator ואקום מבלי להפריע חרוזים מגנטיים. לחלופין, בזהירות להסיר את supernatant עם טפטפת וזורקים supernatant.
- הסר את צלחת מדוכן מגנטי.
- הוסף 100μl פתרון ארנה שטפי זה טוב לטלטל את הצלחת דקה 1 על שייקר מסלולית במהירות בינונית. חרוזים לא יכול לפזר באופן מלא בשלב זה.
- הזז את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים.
- בזהירות לשאוב supernatant עם aspirator ואקום מבלי להפריע חרוזים מגנטיים. לחלופין, בזהירות להסיר את supernatant עם טפטפת וזורקים supernatant.
- הסר את צלחת מדוכן מגנטי.
- חזור על לשטוף זמן 2 nd עם פתרון לשטוף ארנה 100μl.
- לאחר לשטוף 2 nd, לייבש את החרוזים על ידי רועדת את הצלחת דקה 1 על שייקר מסלולית במהירות המקסימלית. אל overdry דגימות!
- Elute ארנה מן החרוזים ידי הוספת מאגר 40μl שחומם מראש ארנה elution לטעום כל אחד.
- בתוקף ללחוץ את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 3 דקות, ואז לבדוק כדי לוודא חרוזים מגנטיים מפוזרים באופן מלא. אם לא, ממשיכים לרעוד.
- לאחר חרוזים מגנטיים התפזרו לגמרי, להעביר את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. Supernatant מכיל את ארנה ניקה-up אמינו allyl משולבים.
- בזהירות העברת ארנה eluted לצלחת PCR חדש (או צינורות PCR).
- (שלב אופציונאלי) בדוק את ריכוז RNA של הדגימות על ידי מדידת 1.5μl על ספקטרופוטומטר NanoDrop.
- מיד להמשיך אל השלב הבא, או לאחסן את ארנה ב -80 ° C.
טבלה 1: 1 סינתזה cDNA רחוב סטרנד מיקס מאסטר
| מגיב | סכום עבור תגובה 1 |
| 10X סטרנד ראשון הצפת | 2 μl |
| dNTP Mix | 4 μl |
| Ribonuclease אינהיביטור | 1 μl |
| מערך סקריפט | 1 μl |
טבלה 2: סטרנד cDNA 2 nd סינתזה מיקס מאסטר
| מגיב | סכום עבור תגובה 1 |
| Nuclease מים חינם | 63 μl |
| 10X סטרנד השנייה הצפת | 10 μl |
| dNTP Mix | 4 μl |
| DNA פולימראז | 2 μl |
| RNase H | 1 μl |
לוח 3: מיקס מאסטר IVT
| מגיב | סכום עבור תגובה 1 |
| aaUTP פתרון (75 mM) | 2 μl |
| ה-ATP, CTP, GTP לערבב (25 mM) | 12 μl |
| T7 UTP פתרון (75 mM) | 2 μl |
| T7 הצפת התגובה 10X | 4 μl |
| T7 מערבבים אנזימים | 4 μl |
טבלה 4: מיקס ארנה הכבילה
| מגיב | סכום עבור תגובה 1 |
| RNA חרוזים עקידת * | 10 μl |
| הפתרון ביד Resuspension * | 4 μl |
| 100% isopropanol ** | 6 μl |
| ארנה תתרכז הצפת הכבילה | 50 μl |
* מערבבים את החרוזים RNA מחייב את הפתרון resuspension החרוז הראשון.
** מוסיפים את isopropanol ומערבבים היטב לפני הוספת להתרכז חיץ מחייב ארנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קריטי שלבים
בסיבוב השני של הגברה לא מומלץ, היות הטיות נתונים מערך נצפו. ערבוב בזהירות בכל שלב האנזימטית (1 st ו - 2 nd סינתזת גדיל cDNA, IVT) הוא קריטי להשגת תשואות הגברה טובה, כמו דגירה של כל צעד האנזימטית בטמפרטורה המתאימה. Cycler PCR עם מכסה מחומם מתכווננת עדיפה - סטיות אפילו קטן כמו 2-3 מעלות במהלך IVT בתנור הכלאה הכלאה אוויר או אמבטיה במים יכול להשפיע באופן משמעותי על תשואה של המוצר מוגבר.
בקשה / משמעות
RNA שכותרתה הנובע פרוטוקול זה יכול להיות הכלאה אל, microarrays האדם ויראלי, או מותאם אישית כדי להעריך ביטוי בתגובות הגן תאים נגועים בתרבות. פלטפורמות microarray להשתנות, ולכן פעל בהתאם להוראות היצרן להכנת תערובת הכלאה בין בדיקה שכותרתו.
באמצעות מערך מעוצב אישית poxvirus 1, הצלחנו לסווג גנים לקטגוריות כללי של "בראשית" או "מאוחר" מבוסס על העיתוי של אות הכלאה והאם שכפול ה-DNA הנגיפי נדרש לגילוי תמליל. ראינו את הקטגוריות פונקציונלי הצפוי של גנים בכל כיתה הזמני (כלומר, צפוי גנים מוקדם, ביניים מאוחר) וריאציה באשר לעיתוי המדויק של שעתוק.
שיטות מנוצל בעבודה זו מסוגלים לחזות גנים וירוס עיבד מוקדם או מאוחר של מחזור השכפול, אך מתקשים יותר להבחין מוקדם בלבד לעומת גנים עם האמרגן מוקדם ומאוחר מאז תמלילי עם מקדם מוקדם / מאוחר כפול עשוי להימשך ולהיות זוהה בשעות המאוחרות. בנוסף, ריצה באמצעות שעתוק של גנים נגיפיים מאוחר עשוי להשפיע על האות ב בדיקה נתון / מקום במערך, כמו רנ"א והכלאה למערך אולי בא מן ORF המיועד או ORF במעלה הזרם. מערכים ריצוף ניסו לפתור בעיה זו, אולם נותרו אתגרים באיתור להפעיל באמצעות שעתוק תוך שימוש בגישות הכלאה מבוסס 2,3,4.
דפוסי מארח תעתיק ניתן להעריך באמצעות שיטות אלה. עם זאת, vaccinia מקודד מגוון של מנגנונים לעכב תגובות המארח, ותגובות מארח תעתיק ניתן פחתה לעומת גירויים אחרים 5,6,7,8. מאז הביטוי של גנים רבים המעורבים בהגנת המארחת משתנה לאחר ההדבקה, התרומה של גנים ויראלי לנטרל התגובות מארח החיסון ולכן צריך להילקח בחשבון.
ניצול שיטות אלה, מפה של עיתוי תעתיק של כל הגנים ויראלי ניתן לזהות ולהשתמש בהם כדי לחקור את התפקידים של גנים ויראליים ידועים. בנוסף, שיטות אלה יכול להיות מנוצל כדי לנתח את הדיאלוג המורכב בין הנגיף לבין המארח. שיטות אלה החלים רחב לארח-הפתוגן מערכות אחרות זיהום. אם הפתוגן של עניין אין polyadenylated mRNAs, שיטות חלופיות ניתן להשתמש ישירות התווית RNA מוחלט, ללא הגברה ליניארית. על ידי ניתוח שני המארח הגן ביטוי וירוס במהלך זיהום סינכרוני, שיטות אלה מאפשרות לנו לקבל תובנה וירוס אינטראקציה עם הסביבה מארח הסלולר, כמו גם לארח נגד הגנות מפני הידבקות בווירוסים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
וייטהד במכון עמיתי קרנות
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
