Summary
Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 2 van 3.
Abstract
De familie
Protocol
Deel 1: cDNA synthese van RNA
- Voordat u de Ambion Amino Allyl MessageAmp II kit, voeg dan de aanbevolen hoeveelheid van 100% ethanol aan het wassen buffers.
- In PCR-reactie reageerbuis, voeg tussen 100ng aan 5μg van totaal RNA en 1μl van T7 oligo (dT) primer. Breng het volume tot 12μl met nuclease-vrij water.
- Incubeer de monsters bij 70 ° C gedurende 10 min in een thermocycler.
- Verwijder de RNA-monsters van 70 ° C en centrifugeer kort. Plaats op het ijs.
- De voorbereiding van de 1 ste Strand Synthese master mix en houd bij kamertemperatuur (met 10% overmaat voor het pipetteren fout). (Tabel 1)
- Voorzichtig pipet Master Mix of stiletto's te mengen, en centrifugeer kort.
- Overdracht 8μl van de Master Mix aan elk RNA-monster. Meng door en neer te pipetteren 3-4 keer.
- Incubeer bij 42 ° C gedurende 2 uur in thermocycler.
- Centrifugeer monsters kort en leg ze op ijs. Ga direct door naar de volgende stap van dsDNA synthese.
- De voorbereiding van de 2 e Strand Synthesis master mix op ijs (met 10% overmaat voor het pipetteren fout). (Tabel 2)
- Voorzichtig pipet Master Mix of stiletto's te mengen, en centrifugeer kort.
- Overdracht 80μl aan elk monster en meng door en neer te pipetteren 3-4 keer.
- Incubeer bij 16 ° C gedurende 2 uur in thermocycler.
- Na de 2 uur incubatie, verder met de cDNA clean-up stap of bevriezen onmiddellijk bij -20 ° C.
Deel 2: Double-cDNA clean-up
- Haal de cDNA Pure uit de koelkast en laat het tot kamertemperatuur temp equilibreren gedurende 30 minuten vóór gebruik. Schud de fles volledig de magnetische cDNA binding bolletjes mengen voor gebruik.
- Aliquot nuclease-vrij water in een 1,5 ml buis en incuberen bij 50-60 ° C gedurende ten minste 10 minuten tijdens de vorige 2 uur incubatie.
- Voeg 180μl van cDNA Pure aan elk monster, en meng grondig door en neer te pipetteren. Overdracht van de monsters naar een 96-goed-ronde bodemplaat.
- Blijf de monsters mix door voorzichtig schudden van de plaat op een orbitale schudder gedurende minstens 2 minuten.
- Verplaats de plaat een magnetische staan om de magnetische korrels vast te leggen. Laat plaat op de stand voor ongeveer 6 minuten, of tot het mengsel wordt transparant en de binding kralen zijn pellets.
- Zorgvuldig aspireren het supernatans met een vacuum aspirator zonder verstoring van het magnetische korrels. Als alternatief, verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant.
- Haal de plaat uit de magnetische stand.
- Voeg 150μl cDNA wasbuffer aan elk putje en schud de plaat gedurende 1 minuut op de orbitale schudder bij gematigde snelheid. Kralen zal NIET verspreiden op deze stap, vanwege de lage oppervlaktespanning van de wasbuffer.
- Verplaats de plaat een magnetische staan om de magnetische korrels vast te leggen.
- Zorgvuldig aspireren het supernatans met een vacuum aspirator zonder verstoring van het magnetische korrels. Als alternatief, verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant.
- Haal de plaat uit de magnetische stand.
- Herhaal de wasbeurt een 2 e tijd met 150μl cDNA Wash Buffer.
- Na de 2 e wassen, drogen de kralen door schudden van de plaat gedurende 2 minuten op de rondschudapparaat op maximale snelheid. Niet Kreukherstellend!
- Elueren het cDNA van de kralen door het toevoegen van 18μl van de voorverwarmde nuclease-vrij water aan elk monster.
- Schud de plaat gedurende 3 minuten op de rondschudapparaat, kijk dan te zorgen dat de magnetische korrels zijn volledig verspreid. Zo niet, dan gaan schudden.
- Zodra de magnetische korrels volledig verspreid, verplaatst u de plaat aan een magnetische staan om de magnetische korrels vast te leggen.
- Zorgvuldig de geëlueerde cDNA (~ 16μl) over te dragen aan een nieuwe PCR-plaat (of PCR-buizen).
- Ga direct naar de volgende stap, of het bevriezen van de cDNA bij -20 ° C.
Deel 3: in vitro transcriptie (IVT)
- Bereid de IVT master mix op kamertemperatuur. (Tabel 3)
- Voorzichtig pipet de Master Mix of stiletto's te mengen, en centrifugeer kort.
- Voeg 24μl aan elk monster, en meng door en neer te pipetteren 3-4 keer.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 14 uur in een thermocycler, houd dan bij 4 ° C tot aan de volgende stap.
Deel 4: ARNA clean-up na IVT
- Vortex het RNA binden beads kort om een homogene massa te verkrijgen voor gebruik.
- Bereid de ARNA Binding Mix bij kamertemperatuur (tabel 4) Dit kan van tevoren worden gedaan. - De voorbereide binding mix kan bewaard worden bij kamertemperatuur tot maximaal een week.
- Meng goed door vortexen.
- Aliquot Het Arna elutiebuffer in een 1,5 ml buis en incuberen bij 50-60 ° C gedurende ten minste 10 minuten.
- Voeg 70μl van de ARNA binding mixaan elk monster en meng goed door en neer te pipetteren 3-4 keer.
- Overdracht van de monsters van de PCR-plaat tot een 96-goed-ronde bodemplaat.
- Voeg 50μl van 100% isopropanol aan elk monster en meng goed door en neer te pipetteren 3-4 keer.
- Schud de plaat op een orbitale schudder gedurende minstens 2 minuten grondig mengen van de monsters.
- Verplaats de plaat een magnetische staan om de magnetische korrels vast te leggen. Laat de plaat op de stand tot het mengsel wordt transparant en de binding kralen zijn pellets.
- Zorgvuldig aspireren het supernatans met een vacuum aspirator zonder verstoring van het magnetische korrels. Als alternatief, verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant.
- Haal de plaat uit de magnetische stand.
- Voeg 100μl ARNA Wash Solution aan elk putje en schud de plaat gedurende 1 minuut op de orbitale schudder bij gematigde snelheid. Korrels kunnen niet volledig uiteen bij deze stap.
- Verplaats de plaat een magnetische staan om de magnetische korrels vast te leggen.
- Zorgvuldig aspireren het supernatans met een vacuum aspirator zonder verstoring van het magnetische korrels. Als alternatief, verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en gooi het supernatant.
- Haal de plaat uit de magnetische stand.
- Herhaal de wasbeurt een 2 e tijd met 100μl ARNA Wash Solution.
- Na de 2 e wassen, drogen de kralen door schudden van de plaat gedurende 1 minuut op de rondschudapparaat op maximale snelheid. Niet Kreukherstellend samples!
- Elueren Het Arna van de kralen door het toevoegen van 40μl voorverwarmde ARNA elutiebuffer aan elk monster.
- Schud de plaat op de orbitale schudder gedurende 3 minuten, daarna moet u controleren of de magnetische korrels zijn volledig verspreid. Zo niet, dan gaan schudden.
- Zodra de magnetische korrels volledig verspreid, verplaatst u de plaat aan een magnetische staan om de magnetische korrels vast te leggen. Het supernatant bevat de schoon-up amino-allyl opgenomen ARNA.
- Breng voorzichtig de geëlueerd ARNA om een nieuwe PCR-plaat (of PCR-buizen).
- (Optioneel stap) Controleer de RNA-concentratie van de monsters door het meten van 1.5μl op een NanoDrop spectrofotometer.
- Onmiddellijk verder naar de volgende stap, of op te slaan Het Arna bij -80 ° C.
Tabel 1: cDNA 1 e Strand Synthese Master Mix
| Reagens | Bedrag voor een reactie |
| 10X Eerste Strand Buffer | 2 pi |
| dNTP Mix | 4 pl |
| Ribonucleaseremmer | 1 pi |
| Array Script | 1 pi |
Tabel 2: cDNA 2 e Strand Synthese Master Mix
| Reagens | Bedrag voor een reactie |
| Nuclease gratis water | 63 pl |
| 10X Tweede Strand Buffer | 10 pi |
| dNTP Mix | 4 pl |
| DNA Polymerase | 2 pi |
| RNase H | 1 pi |
Tabel 3: IVT Master Mix
| Reagens | Bedrag voor een reactie |
| aaUTP oplossing (75 mM) | 2 pi |
| ATP, CTP, GTP mix (25 mM) | 12 pl |
| T7 UTP-oplossing (75 mM) | 2 pi |
| T7 10X reactiebuffer | 4 pl |
| T7 Enzyme Mix | 4 pl |
Tabel 4: ARNA Binding Mix
| Reagens | Bedrag voor een reactie |
| RNA-Bindende Kralen * | 10 pi |
| Bead resuspensie Oplossing * | 4 pl |
| 100% isopropanol ** | 6 pl |
| ARNA Binding Buffer Concentrate | 50 ui |
* Het RNA binden kralen eerste mix met de kraal resuspensie oplossing.
** Voeg de isopropanol en meng goed voor het toevoegen van de ARNA bindende buffer concentreren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen
Een tweede ronde van de versterking wordt afgeraden als vooroordelen in array data zijn waargenomen. Het mengen van zorgvuldig bij elke enzymatische stap (1 e en 2 e streng cDNA synthese, IVT) is van cruciaal belang voor het verkrijgen van een goede versterking opbrengst, net als incubatie van elk enzymatische stap voor stap de juiste temperatuur. Een PCR cycler met verstelbare verwarmde deksel heeft de voorkeur - zelfs afwijkingen zo klein als 2-3 graden tijdens de IVT in een lucht-hybridisatie oven of waterbad hybridisatie kan een aanzienlijke invloed hebben op opbrengst van geamplificeerd product.
Toepassing / Betekenis
De gelabelde RNA als gevolg van dit protocol kan worden gehybridiseerd met mens, virale, of aangepaste microarrays om genexpressie reacties te beoordelen geïnfecteerde cellen in cultuur. Microarray platforms variëren, dus volg instructies van de fabrikant voor de voorbereiding van hybridisatie mengsel uit gelabelde probe.
Met behulp van een speciaal ontworpen pokkenvirus matrix 1, waren we in staat om genen in te delen in de algemene categorieën van "vroege" of "te laat", gebaseerd op de timing van hybridisatie-signaal en het al dan niet virale DNA-replicatie nodig was voor transcriptie detectie. We zagen de verwachte functionele categorieën van genen in elke tijdelijke klasse (dat wil zeggen, de verwachte vroege, intermediaire en late genen) variatie met betrekking tot de precieze timing van de transcriptie.
De methoden gebruikt in dit werk zijn in staat om virus genen vroeg of laat in de replicatiecyclus overgeschreven te voorspellen, maar hebben meer moeite te onderscheiden vroeg alleen-versus genen met een vroege en late promotor sinds transcripten met een dubbele vroege / late promotor kan blijven bestaan en worden gedetecteerd op late tijden. Daarbij mag run-through transcriptie van late virale genen van invloed op het signaal op een gegeven probe / plek op de matrix, zoals de RNA hybridiseren aan de array kan afkomstig zijn van de aangewezen ORF of een upstream ORF. Tiling arrays hebben geprobeerd dit probleem op te lossen, maar uitdagingen blijven bij het opsporen van lopen door transcriptie met behulp van hybridisatie gebaseerde benaderingen 2,3,4.
Host transcriptionele patronen kunnen ook worden beoordeeld met behulp van deze methoden. Echter, vaccinia codeert voor een verscheidenheid van mechanismen om te remmen gastheer reacties, en host transcriptionele respons kan verminderd zijn ten opzichte van andere stimuli 5,6,7,8. Sinds de expressie van vele genen betrokken bij de afweer is veranderd na de infectie, moet de bijdrage van virale genen die host immuunreacties tegen te gaan dan ook rekening worden gehouden.
Gebruik makend van deze methoden kan een kaart van de transcriptionele timing van alle virale genen worden geïdentificeerd en gebruikt om de functies van onbekende virale genen te ondervragen. Daarnaast kunnen deze methoden worden gebruikt om de ingewikkelde dialoog tussen virus en gastheer ontleden. Deze methoden zijn over het algemeen van toepassing op andere gastheer-pathogeen infectie systemen. Als de ziekteverwekker van belang geen gepolyadenyleerde mRNA's, kunnen alternatieve methoden worden gebruikt om direct het etiket van de totaal RNA, zonder lineaire versterking. Door het analyseren van zowel de gastheer en virus genexpressie tijdens de synchrone infectie, deze methoden stellen ons in staat inzicht te krijgen in virus interactie met de gastheer cellulaire omgeving als gastheer contra-afweer tegen virusinfecties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Whitehead Institute Fellows fondsen
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
