Summary
Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux.
Abstract
La famille
Protocol
Partie 1: synthèse de l'ADNc de l'ARN
- Avant d'utiliser le Ambion Amino Allyl MessageAmp II kit, ajouter la quantité recommandée d'éthanol à 100% pour les tampons de lavage.
- Dans le tube de réaction PCR, ajouter entre 100 ng d'ARN total de 5 ug et 1 microlitre de T7 oligo (dT) primer. Porter le volume à 12μl avec une eau sans nucléase.
- Incuber les échantillons à 70 ° C pendant 10 min dans un thermocycleur.
- Retirer les échantillons d'ARN à partir de 70 ° C et centrifuger brièvement. Placez-le sur la glace.
- Préparer le 1 er volet de synthèse master mix et de conserver à température ambiante (avec excédent de 10% pour le pipetage d'erreur). (Tableau 1)
- Mélanger délicatement la pipette ou feuilleter Maître de mélanger, puis centrifuger brièvement.
- Transfert de l'8μl Master Mix pour chaque échantillon d'ARN. Mélanger par aspiration et refoulement 3-4 fois.
- Incuber à 42 ° C pendant 2 heures dans un thermocycleur.
- Centrifuger les échantillons brièvement et placer sur la glace. Procéder immédiatement à l'étape suivante de la synthèse des ADN double brin.
- Préparer le 2 ème volet maîtrise de synthèse mélange sur la glace (avec excédent de 10% pour le pipetage d'erreur). (Tableau 2)
- Mélanger délicatement la pipette ou feuilleter Maître de mélanger, puis centrifuger brièvement.
- Transfert 80μl à chaque échantillon et mélanger délicatement par aspiration et refoulement 3-4 fois.
- Incuber à 16 ° C pendant 2 heures dans un thermocycleur.
- Après l'incubation de 2 heures, procéder à l'ADNc de nettoyage étape ou congeler immédiatement à -20 ° C.
Partie 2: l'ADNc double brin de nettoyage
- Retirez la pure ADNc du réfrigérateur et le laisser se stabiliser à la température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation. Agitez la bouteille pour bien remettre en suspension les perles magnétiques ADNc contraignante avant l'utilisation.
- Aliquoter eau sans nucléase dans un tube de 1,5 ml et incuber à 50-60 ° C pendant au moins 10 minutes pendant l'incubation précédentes 2hr.
- Ajouter 180μl de Pure ADNc de chaque échantillon, et bien mélanger par pipetage de haut en bas. Transférer les échantillons à un 96-même à fond rond assiette.
- Continuer à mélanger les échantillons en agitant la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins 2 minutes.
- Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Laisser la plaque sur le stand pendant environ 6 minutes ou jusqu'à ce que le mélange devient transparent et les perles à caractère contraignant ont granulés.
- Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant.
- Retirer la plaque du socle magnétique.
- Ajouter 150μl de tampon de lavage d'ADNc dans chaque puits et agiter la plaque pendant 1 minute sur l'agitateur orbital à vitesse modérée. Perles va se dispersent pas à cette étape, en raison de la faible tension de surface du tampon de lavage.
- Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques.
- Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant.
- Retirer la plaque du socle magnétique.
- Répéter le lavage une 2 ème fois avec 150μl de tampon de lavage d'ADNc.
- Après le lavage 2 ème, sécher les perles en secouant la plaque pendant 2 minutes sur l'agitateur orbital à la vitesse maximale. Ne pas trop sécher!
- Éluer l'ADNc à partir des billes en ajoutant 18μl de l'préchauffé eau sans nucléase à chaque échantillon.
- Secouez vigoureusement la plaque pendant 3 minutes sur l'agitateur orbital, puis vérifiez que les billes magnétiques sont totalement dispersés. Sinon, continuez secouant.
- Une fois que les billes magnétiques ont complètement dispersé, déplacer la plaque d'un support magnétique pour capturer les billes magnétiques.
- Soigneusement transfert de l'ADNc élué (~ 16μl) d'une nouvelle plaque PCR (ou tubes PCR).
- Passez directement à l'étape suivante, ou geler l'ADNc à -20 ° C.
Partie 3: transcription in vitro (IVT)
- Préparer le mélange maître IVT à température ambiante. (Tableau 3)
- Délicatement la pipette du Master Mix ou à cran de se mélanger, et centrifuger brièvement.
- Ajouter 24μl de chaque échantillon, et mélanger délicatement par aspiration et refoulement 3-4 fois.
- Incuber à 37 ° C pendant 14 heures dans un thermocycleur, puis maintenez à 4 ° C jusqu'au moment de l'étape suivante.
Partie 4: ARNa nettoyage après IVT
- Vortex les perles liaison à l'ARN brièvement pour obtenir un mélange homogène avant utilisation.
- Préparer le ARNa Mix reliure à température ambiante (tableau 4) Cela peut être fait à l'avance -. Le mélange préparé contraignantes peuvent être stockés à température ambiante pendant jusqu'à une semaine.
- Mélangez bien au vortex.
- Aliquoter le tampon d'élution ARNa dans un tube de 1,5 ml et incuber à 50-60 ° C pendant au moins 10 minutes.
- Ajouter 70μl de l'ARNa mélange de liantà chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois.
- Transférer les échantillons de la plaque PCR de 96 puits à fond rond assiette.
- Ajouter 50 pl de 100% d'isopropanol à chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois.
- Secouez doucement la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins 2 minutes pour bien mélanger les échantillons.
- Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Laisser la plaque sur le stand jusqu'à ce que le mélange devient transparent et les perles à caractère contraignant ont granulés.
- Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant.
- Retirer la plaque du socle magnétique.
- Ajouter 100 ul Solution Laver ARNa dans chaque puits et agiter la plaque pendant 1 minute sur l'agitateur orbital à vitesse modérée. Perles peut pas entièrement se dispersent à cette étape.
- Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques.
- Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant.
- Retirer la plaque du socle magnétique.
- Répétez le laver une fois 2 ème avec 100 ul Solution Laver ARNa.
- Après le lavage 2 ème, sécher les perles en secouant la plaque pendant 1 minute sur l'agitateur orbital à la vitesse maximale. Ne pas trop sécher les échantillons!
- Eluer la ARNa des billes en ajoutant 40μl de tampon d'élution préchauffé ARNa à chaque échantillon.
- Secouez vigoureusement la plaque sur l'agitateur orbital pendant 3 minutes, puis vérifiez que les billes magnétiques sont totalement dispersés. Sinon, continuez secouant.
- Une fois que les billes magnétiques ont complètement dispersé, déplacer la plaque d'un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Le surnageant contient les ARNa nettoyé aminés allyle incorporé.
- Soigneusement transférer le ARNa élué à une nouvelle plaque PCR (ou tubes PCR).
- (Étape facultative) Vérifiez la concentration en ARN des échantillons en mesurant 1.5μl sur un spectrophotomètre NanoDrop.
- Immédiatement continuer sur la prochaine étape, ou de stocker l'ARNa à -80 ° C.
Tableau 1: Volet 1 er ADNc Synthèse Mix Master
| Réactifs | Montant pour une réaction |
| Tampon 10X First Strand | 2 pl |
| dNTP Mix | 4 pl |
| Inhibiteur de la ribonucléase | 1 pl |
| Script tableau | 1 pl |
Tableau 2: ADNc 2 ème volet Maître Synthèse Mix
| Réactifs | Montant pour une réaction |
| Eau sans nucléase | 63 ul |
| Tampon 10X deuxième brin | 10 ul |
| dNTP Mix | 4 pl |
| ADN polymérase | 2 pl |
| RNase H | 1 pl |
Tableau 3: IVT Mix Master
| Réactifs | Montant pour une réaction |
| aaUTP solution (75 mM) | 2 pl |
| ATP, CTP, GTP mélange (25 mM) | 12 ul |
| T7 UTP solution (75 mM) | 2 pl |
| Tampon de réaction 10X T7 | 4 pl |
| T7 Enzyme Mix | 4 pl |
Tableau 4: Mélanger ARNa reliure
| Réactifs | Montant pour une réaction |
| Perles liaison à l'ARN * | 10 ul |
| * Remise en suspension de billes Solution | 4 pl |
| 100% d'isopropanol ** | 6 pl |
| Concentré ARNa Binding Buffer | 50 ul |
* Mélanger les perles liaison à l'ARN avec la solution resuspension premier talon.
** Ajouter l'isopropanol et bien mélanger avant d'ajouter le concentré de tampon de liaison ARNa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Étapes critiques
Un second tour de l'amplification n'est pas conseillé que des biais dans les données array ont été observées. Mélanger soigneusement à chaque étape enzymatique (1 er et 2 ème synthèse brin d'ADNc, IVT) est essentielle à l'obtention de rendements d'amplification bon, tout comme l'incubation de chaque étape enzymatique à la température appropriée. Un cycleur PCR avec couvercle chauffant réglable est préféré - les écarts, même aussi petit que 2-3 degrés au cours IVT dans un four l'hybridation de l'air ou l'hybridation bain d'eau peut affecter considérablement le rendement du produit amplifié.
Application / Importance
Les ARN marqués résultant de ce protocole peut être hybridés pour la santé humaine, les biopuces virale, ou de la coutume pour évaluer les réponses expression des gènes dans les cellules infectées en culture. Plates-formes de biopuces varient, alors suivez les instructions du fabricant pour la préparation du mélange d'hybridation de sonde marquée.
En utilisant un tableau de poxvirus personnalisée conçue 1, nous avons été en mesure de classer les gènes dans les catégories générales de «début» ou «en retard» basée sur le calendrier du signal d'hybridation et de si oui ou non réplication de l'ADN viral est nécessaire pour la détection de transcription. Nous avons observé les catégories attendus fonctionnelle des gènes dans chaque classe temporelle (par exemple, devrait gènes précoces, intermédiaire et tardive) des variations quant au moment exact de la transcription.
Les méthodes utilisées dans ce travail sont en mesure de prédire les gènes du virus transcrit tôt ou tard dans le cycle de réplication, mais ont plus de difficulté à distinguer au début uniquement par rapport aux gènes avec un promoteur précoce et tardif puisque les transcriptions avec un double promoteur précoce / tardif peut persister et être détectées à temps de retard. En outre, l'exécution à travers la transcription des gènes viraux fin peuvent affecter le signal à une sonde donnée / tache sur le tableau, comme l'ARN s'hybridant au tableau peut-être venu de l'ORF désigné ou un amont l'ORF. Carrelage tableaux ont tenté de résoudre ce problème, cependant des défis demeurent dans la détection de courir à travers la transcription en utilisant des approches basées hybridation 2,3,4.
Schémas hôte transcriptionnelle peut également être évaluée en utilisant ces méthodes. Toutefois, la vaccine code pour une variété de mécanismes pour inhiber réponses de l'hôte, et réponses de l'hôte de la transcription peut être diminuée par rapport à d'autres stimuli 5,6,7,8. Depuis l'expression de nombreux gènes impliqués dans la défense d'hôte est modifié après l'infection, la contribution des gènes viraux qui neutralisent les réponses immunitaires de l'hôte doivent donc être pris en considération.
En utilisant ces méthodes, une carte de la synchronisation de la transcription des gènes viraux peuvent être identifiés et utilisés pour interroger les fonctions de gènes viraux inconnus. En outre, ces méthodes peuvent être utilisées pour disséquer le dialogue complexe entre le virus et l'hôte. Ces méthodes sont largement applicables à d'autres systèmes d'infection hôte-pathogène. Si l'agent pathogène d'intérêt n'a pas polyadénylé ARNm, des méthodes alternatives peuvent être utilisées pour marquer directement l'ARN total, sans amplification linéaire. En analysant à la fois l'hôte et l'expression des gènes du virus lors de l'infection synchrone, ces méthodes nous permettent de mieux comprendre l'interaction du virus avec l'environnement hôte cellulaire ainsi que l'hôte contre-défenses contre les infections virales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Whitehead Institute Fellows Fonds
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
