Summary
Protokoll för vaccinia infektion av HeLa celler och analys av värd och virus genuttryck. Del 2 av 3.
Abstract
Familjen
Protocol
Del 1: cDNA syntes från RNA
- Innan du använder Ambion Amino Allyl MessageAmp II kit, lägga den rekommenderade volymen på 100% etanol till de tvätta buffertar.
- I PCR-reaktion röret, lägga mellan 100 ng till 5 mikrogram av det totala RNA och 1μl av T7 oligo (DT) primer. Ta upp volymen till 12μl med nukleasfritt vatten.
- Inkubera prov vid 70 ° C i 10 min i en termocykler.
- Ta bort RNA-prover från 70 ° C och centrifugera en kort stund. Placera på is.
- Förbered den 1 Strand blandar Syntes mästare och förvara i rumstemperatur (med 10% överskott för pipettering fel). (Tabell 1)
- Försiktigt pipett Master Mix eller stiletter att blanda och centrifugera en kort stund.
- Överföring 8μl av Master Mix till varje RNA-prov. Blanda genom att pipettera upp och ned 3-4 gånger.
- Inkubera vid 42 ° C i 2 timmar i termocykler.
- Centrifugera prover kort och lägg på is. Omedelbart gå vidare till nästa steg i dsDNA syntes.
- Förbered 2: a Strand blandar Syntes mästare på is (med 10% överskott för pipettering fel). (Tabell 2)
- Försiktigt pipett Master Mix eller stiletter att blanda och centrifugera en kort stund.
- Överföring 80μl till varje prov och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned 3-4 gånger.
- Inkubera vid 16 ° C i 2 timmar i termocykler.
- Efter 2 timmars inkubation, fortsätt med cDNA sanering steg eller frysa omedelbart vid -20 ° C.
Del 2: Dubbel-strängat cDNA sanering
- Ta bort cDNA Ren ur kylskåpet och låt det utjämna till rumstemperatur i 30 minuter före användning. Skaka flaskan för att helt resuspendera magnetiska cDNA bindande kulor före användning.
- Alikvotera nukleasfritt vatten i en 1,5 mL rör och inkubera vid 50-60 ° C under minst 10 minuter under den föregående 2hr inkubation.
- Tillsätt 180μl av cDNA Rent till varje prov och blanda genom att pipettera upp och ned. Överför proverna till ett 96-väl runt bottenplattan.
- Fortsätt att blanda proverna genom att försiktigt skaka plattan på en skakapparat i minst 2 minuter.
- Flytta plattan till en magnetisk stå för att fånga den magnetiska pärlor. Låt plattan på stå i cirka 6 minuter, eller tills blandningen blir transparent och bindande pärlor har pelleterat.
- Försiktigt aspirera supernatanten med en vakuum aspirator utan att störa magnetiska kulor. Alternativt försiktigt bort supernatanten med en pipett och kassera supernatanten.
- Avlägsna plattan från den magnetiska monter.
- Lägg 150μl cDNA tvättbuffert i varje brunn och skaka plåten i 1 minut på skakapparat i måttlig hastighet. Pärlor kommer INTE att skingras i detta steg på grund av den låga ytspänningen på tvättbuffert.
- Flytta plattan till en magnetisk stå för att fånga den magnetiska pärlor.
- Försiktigt aspirera supernatanten med en vakuum aspirator utan att störa magnetiska kulor. Alternativt försiktigt bort supernatanten med en pipett och kassera supernatanten.
- Avlägsna plattan från den magnetiska monter.
- Upprepa tvätta en 2: a gången med 150μl cDNA tvättbuffert.
- Efter 2: a tvätta, torka pärlor genom att skaka plattan i 2 minuter på skakapparat vid högsta hastighet. Låt inte strykfria!
- Eluera cDNA från kulorna genom att lägga 18μl av förvärmd nukleasfritt vatten till varje prov.
- Skaka plattan i 3 minuter på skakapparat, sedan kontrollera att de magnetiska kulor är helt utspridda. Om inte, fortsätter skaka.
- När magnetiska kulor har helt skingrade, flytta plattan till en magnetisk stå för att fånga den magnetiska pärlor.
- Försiktigt överföra elueras cDNA (~ 16μl) till en ny PCR-platta (eller PCR-rör).
- Gå direkt till nästa steg, eller frysa cDNA vid -20 ° C.
Del 3: in vitro transkription (IVT)
- Förbered IVT Master Mix i rumstemperatur. (Tabell 3)
- Försiktigt pipett Master Mix eller stiletter att blanda, och centrifugera kort.
- Tillsätt 24μl till varje prov och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned 3-4 gånger.
- Inkubera vid 37 ° C i 14 timmar i en termocykler, håll sedan vid 4 ° C tills redo för nästa steg.
Del 4: ARNA sanering efter IVT
- Vortex RNA-bindande pärlor kort att få en jämn blandning före användning.
- Förbered ARNA Bindning Mix i rumstemperatur (tabell 4) Detta kan göras i förväg. - Den förberedda bindande blandningen kan förvaras i rumstemperatur i upp till en vecka.
- Blanda väl genom att vortexa.
- Alikvotera den ARNA Elution bufferten i ett 1,5 mL rör och inkubera vid 50-60 ° C i minst 10 minuter.
- Tillsätt 70μl av ARNA bindande mixtill varje prov och blanda väl genom att pipettera upp och ned 3-4 gånger.
- Överför proverna från PCR-plattan till en 96-väl runt bottenplattan.
- Tillsätt 50μl av 100% isopropanol till varje prov och blanda väl genom att pipettera upp och ned 3-4 gånger.
- Skaka försiktigt plattan på en skakapparat i minst 2 minuter för att blanda proverna.
- Flytta plattan till en magnetisk stå för att fånga den magnetiska pärlor. Låt plattan på stativet tills blandningen blir transparent och bindande pärlor har pelleterat.
- Försiktigt aspirera supernatanten med en vakuum aspirator utan att störa magnetiska kulor. Alternativt försiktigt bort supernatanten med en pipett och kassera supernatanten.
- Avlägsna plattan från den magnetiska monter.
- Lägg 100μl ARNA tvättlösning i varje brunn och skaka plåten i 1 minut på skakapparat i måttlig hastighet. Pärlor kanske inte helt skingra i detta steg.
- Flytta plattan till en magnetisk stå för att fånga den magnetiska pärlor.
- Försiktigt aspirera supernatanten med en vakuum aspirator utan att störa magnetiska kulor. Alternativt försiktigt bort supernatanten med en pipett och kassera supernatanten.
- Avlägsna plattan från den magnetiska monter.
- Upprepa tvätta en 2: a gången med 100μl ARNA tvättlösning.
- Efter 2: a tvätta, torka pärlor genom att skaka plattan i 1 minut på skakapparat vid högsta hastighet. Låt inte strykfria prover!
- Eluera ARNA från kulorna genom att lägga 40μl förvärmd ARNA Elution buffert i varje prov.
- Skaka plattan på skakapparat i 3 minuter, sedan kontrollera att de magnetiska kulor är helt utspridda. Om inte, fortsätter skaka.
- När magnetiska kulor har helt skingrade, flytta plattan till en magnetisk stå för att fånga den magnetiska pärlor. Supernatanten innehåller städas upp amino-allyl ingår ARNA.
- Försiktigt överföra elueras ARNA till en ny PCR-platta (eller PCR-rör).
- (Valfritt steg) Kontrollera RNA-koncentrationen av proverna genom att mäta 1.5μl på en NanoDrop spektrofotometer.
- Omedelbart fortsätta till nästa steg, eller förvara ARNA vid -80 ° C.
Tabell 1: cDNA 1 m Strand Syntes Master Mix
| Reagens | Belopp för en reaktion |
| 10X First Strand buffert | 2 l |
| dNTP Mix | 4 l |
| Ribonukleasinhibitor | 1 l |
| Array Script | 1 l |
Tabell 2: cDNA 2: a Strand Syntes Master Mix
| Reagens | Belopp för en reaktion |
| Nukleasfritt fritt vatten | 63 l |
| 10X Andra programområdet buffert | 10 l |
| dNTP Mix | 4 l |
| DNA-polymeras | 2 l |
| RNas H | 1 l |
Tabell 3: IVT Master Mix
| Reagens | Belopp för en reaktion |
| aaUTP lösning (75 mm) | 2 l |
| ATP, CTP, GTP mix (25 mm) | 12 l |
| T7 UTP-lösning (75 mm) | 2 l |
| T7 10X Reaktionsbufferten | 4 l |
| T7 Enzyme Mix | 4 l |
Tabell 4: ARNA Bindning Mix
| Reagens | Belopp för en reaktion |
| RNA Bindande Pärlor * | 10 l |
| Bead resuspension lösning * | 4 l |
| 100% isopropanol ** | 6 l |
| ARNA bindningsbuffert Concentrate | 50 l |
* Blanda RNA bindande pärlor med vulsten resuspension lösningen först.
** Tillsätt isopropanol och blanda väl innan du lägger till ARNA bindningsbuffert koncentrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg
En andra omgång av förstärkning rekommenderas inte som fördomar i rad uppgifter har observerats. Blanda försiktigt vid varje enzymatiska steg (1: a och 2: a strand cDNA syntes, IVT) är avgörande för att få bra förstärkning avkastning, som är inkubationstiden för varje enzymatiska steg i rätt temperatur. En PCR-apparat med justerbara uppvärmda lock är att föredra - även avvikelser så små som 2-3 grader under IVT i en luft hybridisering ugn eller vattenbad hybridisering kan väsentligt påverka avkastningen förstärks produkt.
Ansökan / Betydelse
Den märkta RNA till följd av detta protokoll kan hybridiseras till mänskliga, virus eller anpassade microarrays att bedöma svaren genuttryck för att infekterade celler i kultur. Microarray plattformar varierar, så följ tillverkarens anvisningar för beredning av hybridisering blandning från märkta sonden.
Med hjälp av en specialgjord poxvirus rad 1, kunde vi klassificera gener i den allmänna kategorier av "tidiga" eller "sen" bygger på tidpunkterna för hybridisering signal och huruvida viralt DNA replikation krävdes för avskrift upptäckt. Vi observerade den förväntade funktionella kategorier av gener i varje temporala klass (dvs. förväntad tidig, mellan-och sena gener) variation den exakta tidpunkten för transkription.
De metoder som används i detta arbete kan förutse viruset gener transkriberas tidigt eller sent i replikering cykel, men har svårare att skilja tidiga bara kontra gener med en tidig och sen promotor sedan avskrifter med en dubbel tidigt / sent promotor kan kvarstå och vara upptäcktes vid sena tider. Dessutom kan genomgång transkription av sena virala gener påverkar signal vid en viss sond / fläck på arrayen, vilket RNA hybridisering att arrayen kan ha kommit från den utsedda ORF eller en uppströms ORF. Plattsättning arrayer har försökt att lösa detta problem, men utmaningar återstår att upptäcka köra genom transkription med hybridisering strategier 2,3,4.
Värd transkriptionell mönster kan också bedömas med hjälp av dessa metoder. Men kodar vaccinia en mängd mekanismer för att hämma värd svar, och värd transkriptionell svar kan bli lägre jämfört med andra stimuli 5,6,7,8. Eftersom uttrycket av många gener inblandade i värd försvar förändras efter infektion, bör bidraget av virala gener som motverkar värd immunsvaret därför beaktas.
Med hjälp av dessa metoder kan en karta över transkriptionell timing av alla virala gener kan identifieras och användas för att förhöra funktioner okända virala gener. Dessutom kan dessa metoder användas för att dissekera den intrikata dialogen mellan virus och värd. Dessa metoder är i stort sett tillämpas på andra värd-patogen infektion system. Om den patogen av intresse inte har polyadenylated mRNA, kan alternativa metoder användas för att direkt märka totala RNA, utan linjär förstärkning. Genom att analysera både värd och virus genuttryck under synkron infektion, dessa metoder ger oss möjlighet att få inblick i virus interaktion med värden cellulära miljön liksom värd counter-försvar mot virusangrepp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Whitehead Institute Fellows Fonder
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
