Summary
Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l'espressione genica virale. Parte 2 di 3.
Abstract
La famiglia
Protocol
Parte 1: sintesi di cDNA da RNA
- Prima di utilizzare il Amino Ambion allile MessageAmp II kit, aggiungere il volume consigliato del 100% di etanolo al tamponi di lavaggio.
- In tubo di reazione PCR, aggiungere tra 5μg a 100 ng di RNA totale e 1ml di T7 oligo (dT) primer. Portare il volume fino a 12μl con acqua priva di nucleasi.
- Incubare i campioni a 70 ° C per 10 minuti in un termociclatore.
- Rimuovere campioni di RNA da 70 ° C e centrifugare brevemente. Mettere in ghiaccio.
- Preparare lo Strand 1 ° mix di sintesi master e tenere a temperatura ambiente (con il 10% carico eccessivo per il pipettaggio errore). (Tabella 1)
- Delicatamente Master Mix pipetta o sfiorare per mescolare, quindi si centrifuga brevemente.
- Trasferimento 8μl del Master Mix per ogni campione di RNA. Mescolare pipettando su e giù per 3-4 volte.
- Incubare a 42 ° C per 2 ore in termociclatore.
- Centrifugare i campioni brevemente e posto sul ghiaccio. Procedere immediatamente alla fase successiva della sintesi dsDNA.
- Preparare il Settore 2 ° mix di sintesi master sul ghiaccio (con il 10% carico eccessivo per il pipettaggio errore). (Tabella 2)
- Delicatamente Master Mix pipetta o sfiorare per mescolare, quindi si centrifuga brevemente.
- Trasferire 80μl di ciascun campione e mescolare delicatamente pipettando su e giù per 3-4 volte.
- Incubare a 16 ° C per 2 ore in termociclatore.
- Dopo l'incubazione 2 ore, procedere con il cDNA clean-up o step congelare immediatamente a -20 ° C.
Parte 2: doppia elica del DNA di pulizia
- Rimuovere il puro cDNA dal frigorifero e lasciarlo equilibrare a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso. Agitare il flacone per sospendere di nuovo pienamente le sfere magnetiche cDNA vincolante prima dell'uso.
- Aliquota nucleasi senza acqua in un tubo di 1,5 ml ed incubare a 50-60 ° C per almeno 10 minuti durante l'incubazione precedente 2 ore.
- Aggiungere 180μl di Pure cDNA per ogni campione, e mescolare bene pipettando su e giù. Trasferire i campioni ad un 96-ben a fondo rotondo piatto.
- Continuare a mescolare i campioni scuotendo leggermente il piatto su un agitatore orbitale per almeno 2 minuti.
- Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Lascia piastra sul supporto per circa 6 minuti, o fino a quando il composto diventa trasparente e le palline sono vincolanti pellet.
- Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante.
- Togliere la placca dal supporto magnetico.
- Aggiungere 150μl cDNA tampone di lavaggio in ogni bene e agitare la piastra per 1 minuto l'agitatore orbitale a velocità moderata. Perline NON si disperderà in questa fase, a causa della bassa tensione superficiale del tampone di lavaggio.
- Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche.
- Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante.
- Togliere la placca dal supporto magnetico.
- Ripetere il lavaggio per volta 2 ° con 150μl tampone di lavaggio cDNA.
- Dopo il 2 ° lavare, asciugare le perle agitando la piastra per 2 minuti in agitatore orbitale alla massima velocità. Non asciugare eccessivamente!
- Eluire il cDNA dalla perle aggiungendo 18μl del preriscaldato nucleasi acqua priva di ogni campione.
- Agitare vigorosamente la piastra per 3 minuti mediante l'agitatore orbitale, quindi controllare per assicurarsi che le sfere magnetiche sono completamente disperse. In caso contrario, continuare a tremare.
- Una volta che il sfere magnetiche sono completamente dispersi, spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche.
- Trasferire accuratamente l'cDNA eluiti (~ 16μl) ad una nuova piastra PCR (PCR o tubi).
- Procedere direttamente alla fase successiva, o congelare il cDNA a -20 ° C.
Parte 3: Trascrizione in vitro (IVT)
- Preparare la master mix IVT a temperatura ambiente. (Tabella 3)
- Delicatamente pipetta Master Mix o sfiorare per miscelare e centrifugare brevemente.
- Aggiungere 24μl di ciascun campione e mescolare delicatamente pipettando su e giù per 3-4 volte.
- Incubare a 37 ° C per 14 ore in un termociclatore, quindi tenere a 4 ° C fino al momento per il passo successivo.
Parte 4: ARNA pulizia dopo IVT
- Vortex le perline RNA vincolante per breve tempo ad ottenere un impasto omogeneo prima dell'uso.
- Preparare il Mix Binding ARNA a temperatura ambiente (Tabella 4) Questo può essere fatto prima del tempo -. Mix preparato vincolante può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di una settimana.
- Mescolare bene nel vortex.
- Aliquota del buffer di eluizione ARNA in un tubo di 1,5 ml ed incubare a 50-60 ° C per almeno 10 minuti.
- Aggiungere 70μl della miscela ARNA vincolantead ogni campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte.
- Trasferimento dei campioni dalla piastra PCR ad un 96-ben a fondo rotondo piatto.
- Aggiungere 50μl del 100% di isopropanolo a ciascun campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte.
- Agitare delicatamente la piastra su un agitatore orbitale per almeno 2 minuti per mescolare completamente i campioni.
- Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Lascia la piastra sul supporto fino a quando il composto diventa trasparente e le palline sono vincolanti pellet.
- Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante.
- Togliere la placca dal supporto magnetico.
- Aggiungere 100μl soluzione di lavaggio ARNA in ogni pozzetto e agitare la piastra per 1 minuto l'agitatore orbitale a velocità moderata. Perline potrebbero non disperdere in questa fase.
- Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche.
- Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante.
- Togliere la placca dal supporto magnetico.
- Ripetere il lavaggio per volta 2 ° con la soluzione di 100μl Wash ARNA.
- Dopo il 2 ° lavare, asciugare le perle agitando la piastra per 1 minuto l'agitatore orbitale alla massima velocità. Non asciugare eccessivamente i campioni!
- Eluire la ARNA dalle perle con l'aggiunta di 40μl preriscaldato Elution Buffer ARNA per ogni campione.
- Agitare vigorosamente la piastra l'agitatore orbitale per 3 minuti, quindi controllare per assicurarsi che le sfere magnetiche sono completamente disperse. In caso contrario, continuare a tremare.
- Una volta che il sfere magnetiche sono completamente dispersi, spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Il supernatante contiene la ARNA ripulito amino-allil incorporato.
- Trasferire accuratamente l'ARNA eluiti ad una nuova piastra PCR (PCR o tubi).
- (Passo opzionale) Controllare la concentrazione di RNA dei campioni misurando 1.5μl su uno spettrofotometro NanoDrop.
- Immediatamente continuare al passaggio successivo, o lasciare il ARNA a -80 ° C.
Tabella 1: Mix Strand cDNA 1 ° master di sintesi
| Reagente | Importo per 1 reazione |
| 10X Buffer Strand Primo | 2 microlitri |
| dNTP Mix | 4 microlitri |
| Inibitore di ribonucleasi | 1 ml |
| Array Script | 1 ml |
Tabella 2: Strand cDNA 2 ° Mix sintesi Maestro
| Reagente | Importo per 1 reazione |
| Acqua priva di nucleasi | 63 microlitri |
| 10X Buffer secondo filone | 10 microlitri |
| dNTP Mix | 4 microlitri |
| DNA polimerasi | 2 microlitri |
| RNasi H | 1 ml |
Tabella 3: IVT Master Mix
| Reagente | Importo per 1 reazione |
| aaUTP soluzione (75 mm) | 2 microlitri |
| ATP, CTP, GTP mix (25 mm) | 12 microlitri |
| T7 soluzione UTP (75 mm) | 2 microlitri |
| T7 tampone di reazione 10X | 4 microlitri |
| T7 Enzyme Mix | 4 microlitri |
Tabella 4: Mix ARNA Binding
| Reagente | Importo per 1 reazione |
| Perline RNA Binding * | 10 microlitri |
| Bead Resuspension * Soluzione | 4 microlitri |
| 100% isopropanolo ** | 6 microlitri |
| ARNA Concentrato Binding Buffer | 50 microlitri |
* Mescolare le perline RNA vincolante con la soluzione di risospensione primo tallone.
** Aggiungere l'isopropanolo e mescolare bene prima di aggiungere il legame tampone concentrato ARNA.
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Discussion
Passaggi critici
Un secondo ciclo di amplificazione non è consigliato come pregiudizi nei dati di serie sono stati osservati. Mescolando con cura in ogni fase enzimatica (1 ° e 2 ° sintesi filamento cDNA, IVT) è fondamentale per ottenere buoni rendimenti amplificazione, così come di incubazione di ogni passo enzimatica a temperatura adeguata. Un cycler PCR con regolabile coperchio riscaldato si preferisce - deviazioni anche il più piccolo 2-3 gradi durante IVT in un forno di ibridazione d'aria o bagno ibridazione acqua possono influenzare significativamente la resa del prodotto amplificato.
Applicazione / Significato
L'RNA etichettati derivanti dal presente protocollo può essere ibridato a uomo, microarray virale, o personalizzate per valutare le risposte di espressione genica di cellule infette in coltura. Piattaforma Microarray variare, quindi seguire le istruzioni del produttore per la preparazione della miscela di ibridazione dalla sonda marcata.
Utilizzando una matrice personalizzata poxvirus progettato 1, siamo stati in grado di classificare i geni nelle categorie generali di "early" o "in ritardo" in base alla temporizzazione di segnale di ibridazione e se non la replicazione del DNA virale è stato richiesto per il rilevamento di trascrizione. Abbiamo osservato le categorie atteso funzionali di geni in ciascuna classe temporale (ad esempio, prevede geni precoci, intermedio e in ritardo) variazione per quanto riguarda la tempistica esatta trascrizione.
I metodi utilizzati in questo lavoro sono in grado di predire geni del virus trascritti anticipo o in ritardo nel ciclo di replicazione, ma hanno più difficoltà a distinguere precoce solo contro i geni con un promotore precoce e tardiva poiché trascrizioni con un doppio inizio / fine del promotore può persistere ed essere rilevato, a volte in ritardo. In aggiunta, run-through trascrizione di geni virali in ritardo può influire segnale a una sonda data / spot sulla matrice, come l'RNA ibridazione alla matrice può provenire dal designato ORF o un monte ORF. Array piastrelle hanno tentato di risolvere il problema, tuttavia le sfide restano nella rilevazione attraversano la trascrizione utilizzando approcci basati ibridazione 2,3,4.
Modelli di ospitare trascrizionale può essere valutata anche con questi metodi. Tuttavia, vaccinia codifica per una varietà di meccanismi per inibire le risposte di accoglienza, e le risposte ospitare trascrizionale può essere ridotta rispetto ad altri stimoli 5,6,7,8. Dal momento che l'espressione di molti geni coinvolti nella difesa ospite è alterata dopo l'infezione, il contributo dei geni virali che contrastare risposta immunitaria dovrebbe quindi essere presa in considerazione.
Utilizzando questi metodi, una mappa dei tempi di trascrizione di tutti i geni virali possano essere identificati e usato per interrogare funzioni dei geni virali sconosciute. Inoltre, questi metodi possono essere utilizzati per sezionare il dialogo intricato tra virus e ospite. Questi metodi sono generalmente applicabili ad altri sistemi ospite-patogeno infezione. Se l'agente patogeno di interesse non ha polyadenylated mRNA, metodi alternativi possono essere usati per etichettare direttamente la RNA totale, senza amplificazione lineare. Attraverso l'analisi sia di accoglienza e di espressione genica del virus durante l'infezione sincrona, questi metodi ci permettono di ottenere informazioni in interazione del virus con l'ambiente host cellulare così come contro-ospite difese contro le infezioni da virus.
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Acknowledgments
Whitehead Institute Fellows Fondi
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
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