Summary
بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. الجزء 3 يصف عملية وضع العلامات fluorescently تضخيم الحمض النووي الريبي من كل من المضيف والعينات الفيروسية التي اقتران الآليل الأمينية من الأصباغ. الجزء 3 من 3.
Abstract
الأسرة
Protocol
الجزء 1 : آرنا العلامات : الأمينية اقتران الآليل من الأصباغ
- إضافة 1μg من العينات آرنا في أنابيب microcentrifuge 1.5mL.
- فراغ تجفيف العينات في درجة حرارة منخفضة أو معدومة حتى تجف تماما. سقف كل أنبوب في أقرب وقت كما هو جاف -- لا overdry!
- إضافة إلى اقتران 9μl العازلة لكل أنبوب وresuspend وآرنا بواسطة vortexing بلطف لمدة 1 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع العينات في الجزء السفلي من الأنبوب ثم يسمح العينة الجلوس على الجليد.
- إضافة 22μl DMSO ذات جودة عالية إلى كل أنبوب Cy3 أو Cy5 صباغة. أنبوب واحد من صبغة يكفي لمدة 2 العينات. الصبغة Cy3 هو لوصفها عينات مرجعية الخاص بك ، وصبغ Cy5 هو لوصفها عينات الاختبار.
- دوامة الأصباغ إلى مزيج دقيق. الحفاظ على الأصباغ في الظلام حتى جاهزة للاستخدام. لا تعد صبغة في وقت سابق من 1 ساعة قبل استخدامها. تأكد من عدم الماء يحصل في مزيج صبغ / DMSO في أي لحظة.
- إضافة 11μl الصبغة DMSO / قبرصي على استعداد لكل عينة. مزيج جيد من قبل vortexing بلطف.
- احتضان عن 30-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغطية العينات مع البربون أو الاحتفاظ بها في درج للحد من التعرض للضوء.
- بعد حضانة ، إضافة إلى 4.5μl hydroxlyamine كل عينة لإرواء التفاعل. مزيج جيد من قبل vortexing بلطف.
- احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغطية العينات مع البربون أو الاحتفاظ بها في درج للحد من التعرض للضوء.
الجزء 2 : إعتبر آرنا تنظيف
- دوامة حبات الحمض النووي الريبي ملزمة لفترة وجيزة للحصول على مزيج حتى قبل استخدامها.
- تحضير مزيج آرنا ملزم في درجة حرارة الغرفة (الجدول 1)
- مزيج جيد من قبل vortexing.
- Aliquote الاحتياطي شطف آرنا في أنبوب 1.5mL واحتضان في 50-60 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 10 دقيقة.
- إضافة 70μl من مزيج آرنا ملزمة لكل عينة ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات.
- نقل عينات من لوحة إلى لوحة PCR جولة القاع 96 - جيدا.
- إضافة 50μl 100 ٪ الأيزوبروبانول لكل عينة ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات.
- يهز بلطف على لوحة شاكر المداري على الأقل 2 دقيقة لمزيج دقيق العينات.
- نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي. ترك لوحة على الوقوف حتى يصبح المزيج شفافة والخرز ومكعبات ملزمة.
- نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف. يجب أن يكون إما طاف ردي مشرق أو زرقاء لامعة في هذه المرحلة نظرا لجزيئات صبغة فردية.
- إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
- إضافة محلول الغسيل 100μl آرنا إلى كل بئر ويهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري بسرعة معتدلة. قد لا تفريق حبات تماما في هذه الخطوة.
- نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي.
- نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف.
- إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
- تكرار غسل مرة الثانية مع الحل 2 100μl اغسل آرنا.
- بعد غسل الثانية 2 ، تجفيف الخرز التي تهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري في أقصى سرعة. لا overdry العينات!
- أزل في آرنا من الخرز بإضافة 20μl شطف آرنا محمى الاحتياطي على كل عينة.
- هزة بقوة على لوحة شاكر مدارية لمدة 3 دقائق ، ثم تحقق للتأكد من مشتتة تماما الخرز المغناطيسي. إذا لم يكن كذلك ، لا تزال تهتز.
- مرة واحدة حبات المغناطيسي قد فرقت بشكل كامل ، نقل الى وقفة لوحة المغناطيسي لالتقاط حبات المغناطيسي. وطاف يحتوي على تنظيف ، وعينات آرنا المسمى ، ويجب أن يكون إما وردي شاحب أو أزرق شاحب.
- نقل بعناية آرنا eluted لوحة PCR جديد (أو أنابيب PCR).
- (خطوة اختيارية) للتحقق من تركيز الحمض النووي الريبي وكمية من الصبغة في العينات عن طريق قياس 1.5μl على معمل NanoDrop باستخدام وحدة ميكروأري.
- هجن فورا آرنا صفت على منصة ميكروأري من اختيارك ، أو بدلا من ذلك ، يمكنك تخزين آرنا المسمى في -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للتهجين.
الجدول ميكس آرنا 1 تجليد
| الكاشف | المبلغ : 1 رد الفعل |
| الخرز RNA ملزم * | 10μl |
| حبة * إعادة تعليق الحل | 4μl |
| 100 ٪ الأيزوبروبانول ** | 6μl |
| آرنا مركزة الاحتياطي تجليد | 50μl |
* مزيج من الخرز RNA ملزم معحبة حل إعادة تعليق first
** إضافة الأيزوبروبانول وتخلط جيدا قبل إضافة تركز آرنا العازلة ملزمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة
عند إجراء اقتران الأمينية الآليل ، فمن الأهمية بمكان أن resuspend الصبغة DMSO في فترة وجيزة (أقل من 1 ساعة) قبل توصيل المياه وضمان عدم وجود مزيج يحصل في صبغ / DMSO ، لأنها سوف تتفاعل مع مجموعة نشطة على صباغة. لا overdry الحمض النووي الريبي (يمكن أن تجفف وصولا الى 2uL - 1 بدلا من يجف تماما) ، وكذلك في resuspend العازلة اقتران. خلال رد فعل اقتران ، والحفاظ على رد الفعل في الظلام ، مع التحريك بين الحين وتدور باستمرار إذا رغبت في ذلك.
التطبيق / أهمية
يمكن تهجين الحمض النووي الريبي المسمى الناتجة عن هذا البروتوكول لميكروأرس البشرية والفيروسية ، أو مخصصة لتقييم الاستجابات التعبير الجيني للخلايا المصابة في الثقافة. منصات ميكروأري تختلف ، لذلك اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإعداد خليط من التهجين المسبار المسمى.
باستخدام مجموعة مخصصة الفيروسة الجدرية مصممة 1 ، تمكنا من جينات وراثية في تصنيف فئات عامة من "المبكر" أو "المتأخرة" استنادا إلى توقيت إشارة التهجين وعما إذا كانت أو لم تكن مطلوبة تكرار الحمض النووي الفيروسي للكشف عن نص. لاحظنا في الفئات الوظيفية المتوقعة من الجينات في كل فئة الزمنية (أي في وقت مبكر من المتوقع الجينات والمتوسطة والمتأخرة) والاختلاف في التوقيت الدقيق لالنسخ.
الأساليب المستخدمة في هذا العمل هي قادرة على التنبؤ جينات فيروس كتب في وقت مبكر أو في وقت متأخر من دورة النسخ المتماثل ، ولكن لديها أكثر صعوبة في التمييز المبكر فقط مقابل الجينات مع المروج المبكرة والمتأخرة منذ النصوص مع المروج المبكر / أواخر المزدوج قد تستمر وتكون الكشف في أوقات متأخرة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تعمل من خلال النسخ من الجينات الفيروسية أواخر تؤثر في إشارة التحقيق معين / بقعة على طائفة ، لأن التهجين الحمض النووي الريبي إلى الصفيف قد تأتي من ORF ORF المعينة أو المنبع. صفائف تبليط حاولت حل هذه المشكلة ، ولكن التحديات لا تزال قائمة في كشف من خلال تشغيل النسخ التهجين باستخدام نهج يستند 2،3،4.
ويمكن أيضا أنماط الترانسكربتي المضيف يتم تقييمها باستخدام هذه الأساليب. ومع ذلك ، الوقس بترميز مجموعة متنوعة من الآليات لكبح ردود المضيفة ، وربما يكون تناقص ردود المضيف الترانسكربتي مقارنة مع غيرها من المحفزات 5،6،7،8. منذ يتم تبديل التعبير عن العديد من الجينات تشارك في الدفاع المضيف بعد الإصابة ، ينبغي بالتالي مساهمة الجينات الفيروسية التي مواجهة الاستجابات المناعية للمضيف أن تؤخذ بعين الاعتبار.
باستخدام هذه الأساليب ، ويمكن التعرف على خريطة توقيت الترانسكربتي جميع الجينات الفيروسية وتستخدم لاستجواب وظائف الجينات الفيروسية مجهولة. بالإضافة ، يمكن أن تستخدم هذه الأساليب لتشريح الحوار المعقدة بين الفيروس والمضيف. هذه الأساليب قابلة للتطبيق على نطاق واسع لأنظمة أخرى العدوى المضيف الممرض. إذا لا فائدة من الممرض ومذيل بعديد الأدينيلات mRNAs ، يمكن استخدام أساليب بديلة لتسمية مباشرة على الحمض النووي الريبي مجموع ، دون تضخيم الخطية. من خلال تحليل كل من المضيف وفيروس التعبير الجيني خلال العدوى المتزامنة ، وهذه الأساليب تسمح لنا لاكتساب نظرة ثاقبة فيروس التفاعل مع البيئة المضيف الخلوية وكذلك استضافة دفاعات مضادة ضد عدوى الفيروس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
معهد وايتهيد زملاء صناديق
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
