Summary
פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 3 מתאר את תהליך fluorescently תיוג RNA מוגבר מן המארח והן דגימות ויראלי באמצעות צימוד allyl אמינו של צבעים. חלק 3 מתוך 3.
Abstract
המשפחה
Protocol
חלק 1: ארנה תיוג: צימוד allyl אמינו של צבעים
- הוסף 1μg של דגימות ארנה לתוך צינורות microcentrifuge 1.5mL.
- אבק יבש דגימות על אש נמוכה או לא עד שהם יבשים לחלוטין. שווי כל צינור ברגע שהוא יבש - לא overdry!
- הוסף חוצץ צימוד 9μl אל צינור כל resuspend ארנה ידי בעדינות vortexing דקה 1. צנטריפוגה בקצרה לאסוף את דגימת בתחתית של התחתית, ואחר כך לתת המדגם לשבת על הקרח.
- הוסף 22μl DMSO איכות גבוהה של כל שפופרת צבע Cy3 או Cy5. שפופרת אחת של צבע מספיק 2 דגימות. לצבוע Cy3 היא תיוג דגימות לעיונך, ואת צבע Cy5 היא תיוג דגימות הבדיקה.
- מערבולת צבעים לערבב היטב. שמור את צבעי בחושך עד מוכן לשימוש. אין להכין צבע מוקדם יותר מאשר 1 שעה לפני השימוש. ודא מים לא נכנס לערבב צבע / DMSO בכל נקודה.
- הוסף 11μl של צבע DMSO / סיי מוכן מדגם זה. מערבבים היטב על ידי vortexing בעדינות.
- דגירה של 30-45 דקות בטמפרטורת החדר. מכסים את דגימות עם נייר כסף או לשמור אותם במגירה כדי למזער את החשיפה לאור.
- לאחר דגירה, מוסיפים 4.5μl hydroxlyamine לטעום כל להרוות את התגובה. מערבבים היטב על ידי vortexing בעדינות.
- דגירה לעוד 15 דקות בטמפרטורת החדר. מכסים את דגימות עם נייר כסף או לשמור אותם במגירה כדי למזער את החשיפה לאור.
חלק 2: תווית ארנה לנקות
- וורטקס החרוזים RNA מחייב בקצרה להשיג תערובת אפילו לפני השימוש.
- מכינים את תערובת ארנה איגוד בטמפרטורת החדר. (לוח 1)
- מערבבים היטב על ידי vortexing.
- Aliquote הצפת elution ארנה לתוך צינור דגירה 1.5mL ועל 50-60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות.
- הוסף 70μl של תמהיל ארנה מחייב כל דגימה ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
- העברת דגימות הצלחת PCR לצלחת מסביב לתחתית 96-היטב.
- הוסף 50μl של 100% isopropanol לטעום כל ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
- נער בעדינות את הצלחת על שייקר מסלולית לפחות 2 דקות לערבב ביסודיות את הדגימות.
- הזז את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. השאירו את הצלחת על דוכן העדים עד שהתערובת הופכת שקופה חרוזי מחייב יש pelleted.
- בזהירות לשאוב supernatant עם aspirator ואקום מבלי להפריע חרוזים מגנטיים. לחלופין, בזהירות להסיר את supernatant עם טפטפת וזורקים supernatant. Supernatant צריך להיות או ורוד בהיר או כחול בהיר, בשלב זה, בשל מולקולות צבען מאוגדים.
- הסר את צלחת מדוכן מגנטי.
- הוסף 100μl פתרון ארנה שטפי זה טוב לטלטל את הצלחת דקה 1 על שייקר מסלולית במהירות בינונית. חרוזים לא יכול לפזר באופן מלא בשלב זה.
- הזז את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים.
- בזהירות לשאוב supernatant עם aspirator ואקום מבלי להפריע חרוזים מגנטיים. לחלופין, בזהירות להסיר את supernatant עם טפטפת וזורקים supernatant.
- הסר את צלחת מדוכן מגנטי.
- חזור על לשטוף זמן 2 nd עם פתרון לשטוף ארנה 100μl.
- לאחר לשטוף 2 nd, לייבש את החרוזים על ידי רועדת את הצלחת דקה 1 על שייקר מסלולית במהירות המקסימלית. אל overdry דגימות!
- Elute ארנה מן החרוזים ידי הוספת מאגר 20μl שחומם מראש ארנה elution לטעום כל אחד.
- בתוקף ללחוץ את הצלחת על שייקר מסלולית במשך 3 דקות, ואז לבדוק כדי לוודא חרוזים מגנטיים מפוזרים באופן מלא. אם לא, ממשיכים לרעוד.
- לאחר חרוזים מגנטיים התפזרו לגמרי, להעביר את הצלחת לעמוד מגנטי כדי ללכוד את חרוזים מגנטיים. Supernatant מכיל את ניקה, דגימות ארנה שכותרתו, וצריך להיות או ורוד חיוור או כחול חיוור.
- בזהירות העברת ארנה eluted לצלחת PCR חדש (או צינורות PCR).
- (שלב אופציונאלי) בדוק את ריכוז RNA ואת כמות הצבע בדגימות ידי מדידת 1.5μl על ספקטרופוטומטר NanoDrop באמצעות מודול microarray.
- מיד להכליא ארנה שכותרתו על גבי פלטפורמת microarray של הבחירה שלך, או לחילופין, ניתן לאחסן את ארנה שכותרתו ב -80 ° C עד שאתה מוכן הכלאה.
טבלה 1 ארנה איגוד Mix
| מגיב | סכום עבור תגובה 1 |
| RNA חרוזים עקידת * | 10μl |
| הפתרון ביד Resuspension * | 4μl |
| 100% isopropanol ** | 6μl |
| ארנה תתרכז הצפת הכבילה | 50μl |
* מערבבים את החרוזים RNA מחייב עםחרוז פתרון resuspension first
** מוסיפים את isopropanol ומערבבים היטב לפני הוספת להתרכז חיץ מחייב ארנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קריטי שלבים
בעת ביצוע צימוד allyl אמינו, זה הוא קריטי resuspend לצבוע ב DMSO זמן קצר (פחות מ 1 שעה) לפני צימוד ולהבטיח מים לא נכנס לערבב צבע / DMSO, כפי שהוא יגיב עם קבוצת פעילים על הצבע. אל overdry רנ"א (יכול להיות מיובש עד 1-2uL ולא יבש לגמרי), ואת resuspend היטב למאגר צימוד. במהלך תגובת צימוד, לשמור את התגובה בחושך, עם מצליף מדי פעם ספין למטה אם תרצה בכך.
בקשה / משמעות
RNA שכותרתה הנובע פרוטוקול זה יכול להיות הכלאה אל, microarrays האדם ויראלי, או מותאם אישית כדי להעריך ביטוי בתגובות הגן תאים נגועים בתרבות. פלטפורמות microarray להשתנות, ולכן פעל בהתאם להוראות היצרן להכנת תערובת הכלאה בין בדיקה שכותרתו.
באמצעות מערך מעוצב אישית poxvirus 1, הצלחנו לסווג גנים לקטגוריות כללי של "בראשית" או "מאוחר" מבוסס על העיתוי של אות הכלאה והאם שכפול ה-DNA הנגיפי נדרש לגילוי תמליל. ראינו את הקטגוריות פונקציונלי הצפוי של גנים בכל כיתה הזמני (כלומר, צפוי גנים מוקדם, ביניים מאוחר) וריאציה באשר לעיתוי המדויק של שעתוק.
שיטות מנוצל בעבודה זו מסוגלים לחזות גנים וירוס עיבד מוקדם או מאוחר של מחזור השכפול, אך מתקשים יותר להבחין מוקדם בלבד לעומת גנים עם האמרגן מוקדם ומאוחר מאז תמלילי עם מקדם מוקדם / מאוחר כפול עשוי להימשך ולהיות זוהה בשעות המאוחרות. בנוסף, ריצה באמצעות שעתוק של גנים נגיפיים מאוחר עשוי להשפיע על האות ב בדיקה נתון / מקום במערך, כמו רנ"א והכלאה למערך אולי בא מן ORF המיועד או ORF במעלה הזרם. מערכים ריצוף ניסו לפתור בעיה זו, אולם נותרו אתגרים באיתור להפעיל באמצעות שעתוק תוך שימוש בגישות הכלאה מבוסס 2,3,4.
דפוסי מארח תעתיק ניתן להעריך באמצעות שיטות אלה. עם זאת, vaccinia מקודד מגוון של מנגנונים לעכב תגובות המארח, ותגובות מארח תעתיק ניתן פחתה לעומת גירויים אחרים 5,6,7,8. מאז הביטוי של גנים רבים המעורבים בהגנת המארחת משתנה לאחר ההדבקה, התרומה של גנים ויראלי לנטרל התגובות מארח החיסון ולכן צריך להילקח בחשבון.
ניצול שיטות אלה, מפה של עיתוי תעתיק של כל הגנים ויראלי ניתן לזהות ולהשתמש בהם כדי לחקור את התפקידים של גנים ויראליים ידועים. בנוסף, שיטות אלה יכול להיות מנוצל כדי לנתח את הדיאלוג המורכב בין הנגיף לבין המארח. שיטות אלה החלים רחב לארח-הפתוגן מערכות אחרות זיהום. אם הפתוגן של עניין אין polyadenylated mRNAs, שיטות חלופיות ניתן להשתמש ישירות התווית RNA מוחלט, ללא הגברה ליניארית. על ידי ניתוח שני המארח הגן ביטוי וירוס במהלך זיהום סינכרוני, שיטות אלה מאפשרות לנו לקבל תובנה וירוס אינטראקציה עם הסביבה מארח הסלולר, כמו גם לארח נגד הגנות מפני הידבקות בווירוסים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
וייטהד במכון עמיתי קרנות
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CyDye Post-Labeling Reactive Dye Pack | Reagent | GE Healthcare | RPN5661 | Contains both Cy3 and Cy5 dyes |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
